Megazyme氨測定試劑盒（快速）使用說明書
簡介：
氨是一種廣泛存在的天然化合物，通常由微生物蛋白質(zhì)分解代謝產(chǎn)生，因此可作為果汁、牛奶、奶酪、肉類、海鮮和面包制品的質(zhì)量指標。與其他一些試劑盒不同，這種試劑盒的優(yōu)點是使用了谷氨酸脫氫酶，這種酶不受單寧的抑制，例如葡萄汁和葡萄酒。K-AMIAR可用于手動測定氨（見第4頁“A”）、自動分析儀格式（見第6頁“B”）或微孔板格式（見第7頁“C”）。在葡萄酒工業(yè)中，氨的測定是計算酵母有效氮（YAN）的重要環(huán)節(jié)。YAN包含三種高度可變的成分，游離銨離子、初級氨基氮（來自游離氨基酸）和L-精氨酸側(cè)鏈的貢獻。因此，為了最準確地測定YAN，應(yīng)該對所有三種成分進行定量，這可以使用Megazyme的L-精氨酸/尿素/氨試劑盒（K-LARGE）和NOPA試劑盒（K-PANOPA）。1
原則：
在谷氨酸脫氫酶（GlDH）和還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在下，氨（銨離子；NH）與2-酮戊二酸反應(yīng)生成L-谷氨酸和NADP（1）。4++
（GlDH公司）
（1） 2-酮戊二酸+NADPH+NH L-谷氨酸+NADP+HO4++2
NADP的形成量與氨的量是化學(xué)計量的。它是NADPH消耗量，通過340nm處吸光度的降低來測量。+2
特異性、敏感性、線性和精密度：
該分析對氨有特異性。在試劑級硫酸銨的分析中，預(yù)期結(jié)果約為100%。
測定的最小區(qū)分吸光度為0.005吸光度單位。這相當(dāng)于最大樣品體積為2.00 mL時樣品溶液的濃度為0.018 mg/L。檢測限為0.071 mg/L，其來源于最大樣品體積為2.00 mL時吸光度差為0.020。
在每次測定0.2至7μg氨的范圍內(nèi)，測定呈線性（圖2，第11頁）。使用一種樣品溶液進行兩次測定時，吸光度差可能為0.005至0.010。當(dāng)樣品體積為2.00 mL時，這相當(dāng)于約0.018至0.035 mg/L樣品溶液的氨濃度。如果在樣品制備過程中對樣品進行稀釋，則結(jié)果乘以稀釋系數(shù)F。如果在樣品制備過程中對樣品進行稱重，例如10 g/L，則預(yù)計差值為0.02至0.05 g/100 g。
干擾：
如果在分析規(guī)定的時間內(nèi)（約3分鐘）完成了氨的轉(zhuǎn)化，一般可以得出沒有發(fā)生干擾的結(jié)論。但是，這可以通過在反應(yīng)完成后向反應(yīng)杯中添加氨（約4μg/0.1 mL）來進一步檢查。應(yīng)觀察到吸光度顯著降低。
所分析樣品中的干擾物質(zhì)可通過包括內(nèi)標物來識別。這一標準的定量回收率是可以預(yù)期的。樣品處理和提取過程中的損失通過進行回收實驗來確定，即在最初的提取步驟中向樣品中添加氨水。
在堿性緩沖溶液中，蛋白質(zhì)碎片可能緩慢釋放氨，導(dǎo)致緩慢的蠕變反應(yīng)。這不是這個藥盒的問題，因為反應(yīng)完成得太快了。
果汁中的單寧能顯著抑制牛肉肝中的GlDH，這是一種用于氨水和尿素/氨水試劑盒的酶。然而，此試劑盒中使用的酶不受此限制（圖3，第12頁）。
安全性：
應(yīng)遵守適用于所有化學(xué)物質(zhì)的一般安全措施。
有關(guān)安全使用和處理本產(chǎn)品的更多信息，請參閱Megazyme網(wǎng)站提供的相關(guān)SDS。
工具箱：
可從Megazyme獲得適用于以手動方式進行96次分析（或以自動分析儀方式進行960次分析或以酶標板方式進行960次分析）的試劑盒。試劑盒包含完整的分析方法以及：
瓶子1：緩沖液（36 mL，pH 8.0）加2-酮戊二酸和疊氮化鈉（0.02%w/v）作為防腐劑。在4°C下穩(wěn)定>2年。
瓶子2:（x 2）納德夫。
在-10°C以下穩(wěn)定5年以上。
瓶子3：谷氨酸脫氫酶懸浮液（2.2 mL）。
在4°C下穩(wěn)定>2年。
瓶子4：氨標準溶液（5 mL，0.04 mg/mL）
0.02%（w/v）疊氮化鈉。
穩(wěn)定>2年；密封儲存在4°C。
試劑溶液的制備：
1. 使用提供的瓶子1的內(nèi)容物。在4°C下穩(wěn)定>2年。
2. 在12毫升蒸餾水中溶解第2瓶的內(nèi)容物。在4°C下穩(wěn)定4周或在-10°C以下穩(wěn)定2年以上（為避免重復(fù)的凍融循環(huán)，分為大小合適的小份并儲存在聚丙烯管中）。
3 & 4.使用提供的瓶子3和瓶子4的內(nèi)容物。將瓶子直立存放。使用前旋轉(zhuǎn)瓶子3以混合內(nèi)容物。在4°C下穩(wěn)定>2年，穩(wěn)定>2年；在4°C下密封儲存。
注：注：氨標準溶液僅在對所用分光光度計的準確性有疑問或懷疑樣品中的物質(zhì)引起抑制的情況下進行分析。氨的濃度直接由NADPH的消光系數(shù)決定（第5頁）。
設(shè)備（推薦）：
1. 玻璃試管（圓底；16 x 100 mm）。
2. 一次性塑料試管（1厘米光路，3.0毫升）。
3. 微量移液器，例如Gilson移液器（100μL）。®
4. 容積式移液器，如Eppendorf Multipette®
- 與12.5 mL Combitip[分配0.5 mL等分NADPH緩沖液（溶液2）]。®
- 用25 mL Combitip（分配2.0 mL蒸餾水）。®
5. 分析天平。
6. 分光光度計設(shè)置為340nm。
7. 渦流混合器（如IKA Yellowline試管振動篩TTS2）。®
8. 停止計時。
9. Whatman 1號（9厘米）濾紙。
A、 手動分析程序：
逆風(fēng)閱讀（光路上沒有反應(yīng)杯）或靠水
*例如，用塑料楔子或用反應(yīng)杯蓋或薄膜密封反應(yīng)杯后輕輕翻轉(zhuǎn)。®
如果樣品的“蠕變”率大于空白，則將吸收（樣品和空白）推回到懸浮液3的加入時間。
計算：
測定空白和樣品的吸光度差（A-A）。從樣品吸光度差中減去空白吸收差，從而獲得δA。12氨
ΔA的值通常應(yīng)至少為0.100吸光度單位，以獲得足夠準確的結(jié)果。氨
氨的濃度可計算如下：
如果樣品在制備過程中被稀釋，則結(jié)果必須乘以稀釋系數(shù)F。
在分析為制備樣品而稱重的固體和半固體樣品時，含量（g/100 g）根據(jù)稱重量計算如下：
氨含量
=cammonia[g/L樣品溶液]x 100[g/100 g]
重量[g/L樣品溶液]樣品
注：這些計算可以通過使用Megazyme Mega CalcTM來簡化，可從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com).
B、 自動分析儀分析程序：
筆記：
1. 氨的自動分析儀分析程序可使用單點標準或全校準曲線進行。
2. 對于用于氨測定的每批樣品，必須同時使用同一批試劑執(zhí)行單點標準或校準曲線。
試劑制備如下：
R1的制備：
R2的制備：
示例方法：
C、 微孔板分析程序：
筆記：
1. 氨的微孔板分析程序可以使用單點標準或全校準曲線進行。
2. 對于用于氨測定的每批樣品，必須同時使用同一批試劑執(zhí)行單點標準或校準曲線。
*例如，使用微孔板搖床、微孔板讀卡器上的搖床功能或重復(fù)抽吸（例如，使用容量為50-100μL的移液器）。
**如果樣品的“蠕變”率大于空白，則將樣品吸光度推回到懸浮液3的加入時間。
計算（微孔板分析程序）：g/L=ΔA x g/L標準x F樣品
ΔA標準
如果樣品在制備過程中被稀釋，則結(jié)果必須乘以稀釋系數(shù)F。
圖1。顯示K-AMIAR線性的校準曲線。用于產(chǎn)生該校準曲線的反應(yīng)在37℃下使用10 mm路徑長度的反應(yīng)杯進行5 min。
樣品制備（手工格式，A）：
1樣品稀釋。
反應(yīng)杯（即0.1 mL待分析樣品）中的氨含量應(yīng)在0.2和7μg之間。因此，樣品溶液必須充分稀釋，以產(chǎn)生0.01和0.07 g/L之間的氨濃度。
稀釋表
如果ΔA的值太低（例如<0.100），則稱取更多樣品或稀釋得不太強烈�；蛘�，通過移液管將樣品體積增加至2.00 mL，確保反應(yīng)中樣品和蒸餾水成分的總和為2.10 mL，并使用方程式中的新樣品體積。
2樣品澄清：
Carrez試劑不能用于脫蛋白，因為它們的使用導(dǎo)致回收率顯著降低。使用高氯酸或三氯乙酸作為替代品（見具體示例）。
三。一般考慮。
（a） 液體樣品：透明、淺色和近似中性的液體樣品可直接用于分析。
（b） 酸性樣品：如果使用>0.1 mL的未稀釋酸性樣品（如葡萄酒或果汁），則可能需要使用2 M NaOH將溶液的pH值增加至約8.0。
（c） 二氧化碳：含有大量二氧化碳的樣品應(yīng)通過使用2 M NaOH將pH值增加至約8.0并輕輕攪拌或使用玻璃棒攪拌來脫氣。
（d） 彩色樣品：如果需要，對于彩色樣品，應(yīng)進行空白樣品，即不含GlDH的樣品。
（e） 顏色強烈的樣品：如果使用未稀釋、顏色強烈的樣品，應(yīng)添加0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）/10 mL樣品進行處理。用力搖晃試管5分鐘，然后用Whatman 1號濾紙過濾。
（f） 固體樣品：在蒸餾水中均勻化或粉碎固體樣品，必要時過濾。
（g） 含脂肪樣品：在高于脂肪熔點的溫度下用熱水提取此類樣品，例如在60°C的100 mL容量瓶中。調(diào)整至室溫，并用蒸餾水填充容量瓶中至刻度。在冰上或冰箱中保存15-30分鐘，然后過濾。丟棄前幾毫升濾液，并使用透明上清液（可能有點乳白色）進行分析。
（h） 含有蛋白質(zhì)的樣品：通過加入等量的1 M冰高氯酸并混合，使含有蛋白質(zhì)的樣品脫蛋白。以1500 g離心10分鐘，并用1 M KOH中和上清液。或者，使用如下樣品制備實例（c）中所述的三氯乙酸。
樣品制備示例：
（a） 葡萄汁/葡萄酒中氨的測定。一般來說，白葡萄汁和紅葡萄汁/果醬和葡萄酒中的氨濃度可以在不進行任何樣品處理的情況下進行測定（過濾除外，必要時根據(jù)稀釋表進行稀釋）。如果要分析體積大于25μL的紅酒，可能需要通過添加0.2 g PVPP/10 mL樣品去除部分顏色。用力搖晃試管5分鐘，然后用Whatman 1號濾紙過濾。通常，不需要稀釋，25-50μL的樣品體積是令人滿意的。
（b） 果汁（如橙汁）中氨的測定。
使用2 M NaOH將25 mL過濾樣品的pH值調(diào)節(jié)至約8.0。將溶液定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用蒸餾水調(diào)節(jié)至所需體積。如果溶液顏色很深，可能需要添加0.2 g PVPP/10 mL樣品以去除部分顏色。用力搖晃試管5分鐘，然后用Whatman 1號濾紙過濾。通常，不需要稀釋，0.1 mL的樣品體積是令人滿意的。
（c） 牛奶中氨的測定。
在玻璃試管中，精確混合1毫升牛奶和3毫升牛奶
0.3M三氯乙酸。在室溫下培養(yǎng)5分鐘以確保蛋白質(zhì)完全沉淀，然后在室溫下離心3分鐘（2000 g）。傾析上清液，并使用pH測試條，用10 M KOH中和（高濃度KOH導(dǎo)致體積顯著增加）。過濾，直接用清清上清液進行分析。一般情況下，不需要進一步稀釋，需要最大2.0 mL的樣品體積。
（d） 烘烤產(chǎn)品中氨的測定。
準確稱取約10 g代表性材料，放入100 mL溶液中
杜蘭瓶。添加20 mL 1 M高氯酸并均化®
使用Ultra turrax或Polytron均質(zhì)機（或同等設(shè)備）2分鐘。定量轉(zhuǎn)移至40 mL玻璃燒杯中，并使用2 M KOH將pH調(diào)節(jié)至約8.0。定量轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用蒸餾水調(diào)至刻度（確保含脂層“在”刻度上，水層“在”刻度上）。在冰上儲存20分鐘以沉淀高氯酸鉀，并使脂肪分離。過濾，丟棄前3-5 mL，并使用澄清濾液進行分析。通常，不需要進一步稀釋，0.5 mL的樣品體積是令人滿意的。®®
（e） 肉和肉制品中氨的測定。
準確稱取約5 g代表性材料放入100 mL Duran瓶中。添加20 mL 1 M高氯酸并使用Ultra turrax或Polytron均化器（或等效物）均化2分鐘。定量轉(zhuǎn)移至40 mL玻璃燒杯中，并使用2 M KOH將pH調(diào)節(jié)至約8.0。定量轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用蒸餾水調(diào)至刻度（確保含脂層“在”刻度上，水層“在”刻度上）。在冰上儲存20分鐘以沉淀高氯酸鉀，并使脂肪分離。過濾，丟棄前3-5 mL，并使用澄清濾液進行分析。通常，不需要進一步稀釋，0.5 mL的樣品體積是令人滿意的。®®®
（f） 甘草制品中氨的測定。使用杵和研缽使約3g樣品均勻化，并準確稱取約1g代表性材料至100ml容量瓶中。加入60毫升蒸餾水，在70℃下孵育10分鐘，或直至完全溶解。使其平衡至室溫，并用蒸餾水填充至標記處。過濾并使用略帶顏色的濾液進行分析。通常，不需要進一步稀釋，0.5 mL的樣品體積是令人滿意的。
（g） 水中氨的測定（如游泳池水）。
水的氨濃度通常可以不經(jīng)任何樣品處理而測定。一般情況下，不需要稀釋，需要2.0 mL的樣品體積。
氨是一種廣泛存在的天然化合物，通常由微生物蛋白質(zhì)分解代謝產(chǎn)生，因此可作為果汁、牛奶、奶酪、肉類、海鮮和面包制品的質(zhì)量指標。與其他一些試劑盒不同，這種試劑盒的優(yōu)點是使用了谷氨酸脫氫酶，這種酶不受單寧的抑制，例如葡萄汁和葡萄酒。K-AMIAR可用于手動測定氨（見第4頁“A”）、自動分析儀格式（見第6頁“B”）或微孔板格式（見第7頁“C”）。在葡萄酒工業(yè)中，氨的測定是計算酵母有效氮（YAN）的重要環(huán)節(jié)。YAN包含三種高度可變的成分，游離銨離子、初級氨基氮（來自游離氨基酸）和L-精氨酸側(cè)鏈的貢獻。因此，為了最準確地測定YAN，應(yīng)該對所有三種成分進行定量，這可以使用Megazyme的L-精氨酸/尿素/氨試劑盒（K-LARGE）和NOPA試劑盒（K-PANOPA）。1
原則：
在谷氨酸脫氫酶（GlDH）和還原煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）存在下，氨（銨離子；NH）與2-酮戊二酸反應(yīng)生成L-谷氨酸和NADP（1）。4++
（GlDH公司）
（1） 2-酮戊二酸+NADPH+NH L-谷氨酸+NADP+HO4++2NADP的形成量與氨的量是化學(xué)計量的。它是NADPH消耗量，通過340nm處吸光度的降低來測量。+2
特異性、敏感性、線性和精密度：
該分析對氨有特異性。在試劑級硫酸銨的分析中，預(yù)期結(jié)果約為100%。
測定的最小區(qū)分吸光度為0.005吸光度單位。這相當(dāng)于最大樣品體積為2.00 mL時樣品溶液的濃度為0.018 mg/L。檢測限為0.071 mg/L，其來源于最大樣品體積為2.00 mL時吸光度差為0.020。
在每次測定0.2至7μg氨的范圍內(nèi)，測定呈線性（圖2，第11頁）。使用一種樣品溶液進行兩次測定時，吸光度差可能為0.005至0.010。當(dāng)樣品體積為2.00 mL時，這相當(dāng)于約0.018至0.035 mg/L樣品溶液的氨濃度。如果在樣品制備過程中對樣品進行稀釋，則結(jié)果乘以稀釋系數(shù)F。如果在樣品制備過程中對樣品進行稱重，例如10 g/L，則預(yù)計差值為0.02至0.05 g/100 g。
干擾：
如果在分析規(guī)定的時間內(nèi)（約3分鐘）完成了氨的轉(zhuǎn)化，一般可以得出沒有發(fā)生干擾的結(jié)論。但是，這可以通過在反應(yīng)完成后向反應(yīng)杯中添加氨（約4μg/0.1 mL）來進一步檢查。應(yīng)觀察到吸光度顯著降低。
所分析樣品中的干擾物質(zhì)可通過包括內(nèi)標物來識別。這一標準的定量回收率是可以預(yù)期的。樣品處理和提取過程中的損失通過進行回收實驗來確定，即在最初的提取步驟中向樣品中添加氨水。
在堿性緩沖溶液中，蛋白質(zhì)碎片可能緩慢釋放氨，導(dǎo)致緩慢的蠕變反應(yīng)。這不是這個藥盒的問題，因為反應(yīng)完成得太快了。
果汁中的單寧能顯著抑制牛肉肝中的GlDH，這是一種用于氨水和尿素/氨水試劑盒的酶。然而，此試劑盒中使用的酶不受此限制（圖3，第12頁）。
安全性：
應(yīng)遵守適用于所有化學(xué)物質(zhì)的一般安全措施。
有關(guān)安全使用和處理本產(chǎn)品的更多信息，請參閱Megazyme網(wǎng)站提供的相關(guān)SDS。
工具箱：
可從Megazyme獲得適用于以手動方式進行96次分析（或以自動分析儀方式進行960次分析或以酶標板方式進行960次分析）的試劑盒。試劑盒包含完整的分析方法以及：
瓶子1：緩沖液（36 mL，pH 8.0）加2-酮戊二酸和疊氮化鈉（0.02%w/v）作為防腐劑。在4°C下穩(wěn)定>2年。
瓶子2:（x 2）納德夫。
在-10°C以下穩(wěn)定5年以上。
瓶子3：谷氨酸脫氫酶懸浮液（2.2 mL）。
在4°C下穩(wěn)定>2年。
瓶子4：氨標準溶液（5 mL，0.04 mg/mL）
0.02%（w/v）疊氮化鈉。
穩(wěn)定>2年；密封儲存在4°C。
試劑溶液的制備：
1. 使用提供的瓶子1的內(nèi)容物。在4°C下穩(wěn)定>2年。
2. 在12毫升蒸餾水中溶解第2瓶的內(nèi)容物。在4°C下穩(wěn)定4周或在-10°C以下穩(wěn)定2年以上（為避免重復(fù)的凍融循環(huán)，分為大小合適的小份并儲存在聚丙烯管中）。
3 & 4.使用提供的瓶子3和瓶子4的內(nèi)容物。將瓶子直立存放。使用前旋轉(zhuǎn)瓶子3以混合內(nèi)容物。在4°C下穩(wěn)定>2年，穩(wěn)定>2年；在4°C下密封儲存。
注：注：氨標準溶液僅在對所用分光光度計的準確性有疑問或懷疑樣品中的物質(zhì)引起抑制的情況下進行分析。氨的濃度直接由NADPH的消光系數(shù)決定（第5頁）。
設(shè)備（推薦）：
1. 玻璃試管（圓底；16 x 100 mm）。
2. 一次性塑料試管（1厘米光路，3.0毫升）。
3. 微量移液器，例如Gilson移液器（100μL）。®
4. 容積式移液器，如Eppendorf Multipette®
- 與12.5 mL Combitip[分配0.5 mL等分NADPH緩沖液（溶液2）]。®
- 用25 mL Combitip（分配2.0 mL蒸餾水）。®
5. 分析天平。
6. 分光光度計設(shè)置為340nm。
7. 渦流混合器（如IKA Yellowline試管振動篩TTS2）。®
8. 停止計時。
9. Whatman 1號（9厘米）濾紙。
A、 手動分析程序：
| 波長： | 340牛米 |
| 反應(yīng)杯： | 1 cm光路（玻璃或塑料） |
| 溫度： | ~25攝氏度 |
| 最終體積： | 2.62毫升 |
| 樣品溶液： | 每比色杯0.2-7.0μg氨 |
| （0.1-2.0 mL樣品體積） |
| 用移液管移到試管中 | 空白 | 樣品 |
| 蒸餾水（約25°C） 樣品 溶液1（緩沖液）溶液2（NADPH） |
2.10毫升 - 0.30毫升 0.20毫升 |
2.00毫升0.10毫升0.30毫升 0.20毫升 |
| 混合*，大約2分鐘后讀取溶液（A）的吸光度，并通過添加以下物質(zhì)開始反應(yīng)：1 | ||
| 懸架3（GlDH） | 0.02毫升 | 0.02毫升 |
| 混合*并在反應(yīng)結(jié)束時（約5分鐘）讀取溶液（A）的吸光度。如果反應(yīng)在5分鐘后仍未停止，則繼續(xù)每隔1分鐘讀取吸光度，直到吸光度保持不變或持續(xù)增加2 1分鐘**。 |
||
如果樣品的“蠕變”率大于空白，則將吸收（樣品和空白）推回到懸浮液3的加入時間。
計算：
測定空白和樣品的吸光度差（A-A）。從樣品吸光度差中減去空白吸收差，從而獲得δA。12氨
ΔA的值通常應(yīng)至少為0.100吸光度單位，以獲得足夠準確的結(jié)果。氨
氨的濃度可計算如下：
| c=V×MW×ΔA氨 εx d x v 哪里： V=最終體積【mL】 MW=氨的分子量[g/mol]ε=340nm處NADPH的消光系數(shù) =6300[l x mol x cm]d=光路[cm]v=樣品體積[mL]-1-1 氨氣如下： |
[克/升] |
c=2.62 x 17.03 xΔA氨 6300 x 1.0 x 0.10毫米 =0.07082 xΔA氨 |
[克/升] [克/升] |
在分析為制備樣品而稱重的固體和半固體樣品時，含量（g/100 g）根據(jù)稱重量計算如下：
氨含量
=cammonia[g/L樣品溶液]x 100[g/100 g]重量[g/L樣品溶液]樣品
注：這些計算可以通過使用Megazyme Mega CalcTM來簡化，可從Megazyme網(wǎng)站上的產(chǎn)品下載(www.megazyme.com).
B、 自動分析儀分析程序：
筆記：
1. 氨的自動分析儀分析程序可使用單點標準或全校準曲線進行。
2. 對于用于氨測定的每批樣品，必須同時使用同一批試劑執(zhí)行單點標準或校準曲線。
試劑制備如下：
R1的制備：
| 組成部分 | 體積 |
| 蒸餾水溶液1（緩沖）瓶2（NADPH） | 60毫升 12毫升 8毫升（向瓶子2中加入12毫升HO后）2 |
| 總體積 | 80毫升 |
| 組成部分 | 體積 |
| 蒸餾水溶液1（緩沖液）懸浮液3（GlDH） | 6.8毫升0.5毫升 0.7毫升 |
| 總體積 | 8.0毫升 |
| R1級： | 0.200毫升 |
| 樣品： | ~0.01毫升 |
| R2級： | 0.025毫升 |
| 反應(yīng)時間： | 25°C或37°C下約5分鐘 |
| 波長： | 340牛米 |
| 配制試劑穩(wěn)定性： | >冷藏7天 |
| 計算： | 終結(jié)點 |
| 反應(yīng)方向： | 減少 |
| 線性度： | 使用高達62 mg/L的氨 0.01 mL樣品體積 |
筆記：
1. 氨的微孔板分析程序可以使用單點標準或全校準曲線進行。
2. 對于用于氨測定的每批樣品，必須同時使用同一批試劑執(zhí)行單點標準或校準曲線。
| 波長： | 340牛米 | ||||
| 微孔板： | 96井（如透明平底、玻璃或塑料） | ||||
| 溫度： | ~25攝氏度 | ||||
| 最終體積： | 0.262毫升 | ||||
| 線性度： | 每口井0.1-0.7μg氨 | ||||
| （0.01-0.2 mL樣品體積） | |||||
| 用移液管注入井內(nèi) | 空白 | 樣品 | 標準 | ||
| 蒸餾水樣品溶液標準溶液1（緩沖液）溶液2（NADPH） | 0.210毫升 - - 0.030毫升 0.020毫升 |
0.200毫升 0.010毫升 - 0.030毫升 0.020毫升 |
0.200毫升 - 0.010毫升0.030毫升 0.020毫升 |
||
| 混合*，大約2分鐘后讀取溶液（A）的吸光度，并通過添加以下物質(zhì)開始反應(yīng)：1 | |||||
| 懸架3（GlDH） | 0.002毫升 | 0.002毫升 | 0.002毫升 | ||
| 混合*并在反應(yīng)結(jié)束時（約5分鐘）讀取溶液（A）的吸光度。如果反應(yīng)在5分鐘后仍未停止，則繼續(xù)每隔1分鐘讀取吸光度，直到吸光度在1分鐘內(nèi)持續(xù)增加**。2 | |||||
**如果樣品的“蠕變”率大于空白，則將樣品吸光度推回到懸浮液3的加入時間。
計算（微孔板分析程序）：g/L=ΔA x g/L標準x F樣品
ΔA標準
如果樣品在制備過程中被稀釋，則結(jié)果必須乘以稀釋系數(shù)F。
圖1。顯示K-AMIAR線性的校準曲線。用于產(chǎn)生該校準曲線的反應(yīng)在37℃下使用10 mm路徑長度的反應(yīng)杯進行5 min。
樣品制備（手工格式，A）：
1樣品稀釋。
反應(yīng)杯（即0.1 mL待分析樣品）中的氨含量應(yīng)在0.2和7μg之間。因此，樣品溶液必須充分稀釋，以產(chǎn)生0.01和0.07 g/L之間的氨濃度。
稀釋表
| 估計濃度 | 稀釋 | 稀釋 |
| 氨（g/L） | 有水嗎 | 系數(shù)（F） |
| < 0.07 | 無需稀釋 | 1 |
| 0.07-0.7 | 1 + 9 | 10 |
| 0.7-7.0 | 1 + 99 | 100 |
2樣品澄清：
Carrez試劑不能用于脫蛋白，因為它們的使用導(dǎo)致回收率顯著降低。使用高氯酸或三氯乙酸作為替代品（見具體示例）。
三。一般考慮。
（a） 液體樣品：透明、淺色和近似中性的液體樣品可直接用于分析。
（b） 酸性樣品：如果使用>0.1 mL的未稀釋酸性樣品（如葡萄酒或果汁），則可能需要使用2 M NaOH將溶液的pH值增加至約8.0。
（c） 二氧化碳：含有大量二氧化碳的樣品應(yīng)通過使用2 M NaOH將pH值增加至約8.0并輕輕攪拌或使用玻璃棒攪拌來脫氣。
（d） 彩色樣品：如果需要，對于彩色樣品，應(yīng)進行空白樣品，即不含GlDH的樣品。
（e） 顏色強烈的樣品：如果使用未稀釋、顏色強烈的樣品，應(yīng)添加0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）/10 mL樣品進行處理。用力搖晃試管5分鐘，然后用Whatman 1號濾紙過濾。
（f） 固體樣品：在蒸餾水中均勻化或粉碎固體樣品，必要時過濾。
（g） 含脂肪樣品：在高于脂肪熔點的溫度下用熱水提取此類樣品，例如在60°C的100 mL容量瓶中。調(diào)整至室溫，并用蒸餾水填充容量瓶中至刻度。在冰上或冰箱中保存15-30分鐘，然后過濾。丟棄前幾毫升濾液，并使用透明上清液（可能有點乳白色）進行分析。
（h） 含有蛋白質(zhì)的樣品：通過加入等量的1 M冰高氯酸并混合，使含有蛋白質(zhì)的樣品脫蛋白。以1500 g離心10分鐘，并用1 M KOH中和上清液。或者，使用如下樣品制備實例（c）中所述的三氯乙酸。
樣品制備示例：
（a） 葡萄汁/葡萄酒中氨的測定。一般來說，白葡萄汁和紅葡萄汁/果醬和葡萄酒中的氨濃度可以在不進行任何樣品處理的情況下進行測定（過濾除外，必要時根據(jù)稀釋表進行稀釋）。如果要分析體積大于25μL的紅酒，可能需要通過添加0.2 g PVPP/10 mL樣品去除部分顏色。用力搖晃試管5分鐘，然后用Whatman 1號濾紙過濾。通常，不需要稀釋，25-50μL的樣品體積是令人滿意的。
（b） 果汁（如橙汁）中氨的測定。
使用2 M NaOH將25 mL過濾樣品的pH值調(diào)節(jié)至約8.0。將溶液定量轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并用蒸餾水調(diào)節(jié)至所需體積。如果溶液顏色很深，可能需要添加0.2 g PVPP/10 mL樣品以去除部分顏色。用力搖晃試管5分鐘，然后用Whatman 1號濾紙過濾。通常，不需要稀釋，0.1 mL的樣品體積是令人滿意的。
（c） 牛奶中氨的測定。
在玻璃試管中，精確混合1毫升牛奶和3毫升牛奶
0.3M三氯乙酸。在室溫下培養(yǎng)5分鐘以確保蛋白質(zhì)完全沉淀，然后在室溫下離心3分鐘（2000 g）。傾析上清液，并使用pH測試條，用10 M KOH中和（高濃度KOH導(dǎo)致體積顯著增加）。過濾，直接用清清上清液進行分析。一般情況下，不需要進一步稀釋，需要最大2.0 mL的樣品體積。
（d） 烘烤產(chǎn)品中氨的測定。
準確稱取約10 g代表性材料，放入100 mL溶液中
杜蘭瓶。添加20 mL 1 M高氯酸并均化®
使用Ultra turrax或Polytron均質(zhì)機（或同等設(shè)備）2分鐘。定量轉(zhuǎn)移至40 mL玻璃燒杯中，并使用2 M KOH將pH調(diào)節(jié)至約8.0。定量轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用蒸餾水調(diào)至刻度（確保含脂層“在”刻度上，水層“在”刻度上）。在冰上儲存20分鐘以沉淀高氯酸鉀，并使脂肪分離。過濾，丟棄前3-5 mL，并使用澄清濾液進行分析。通常，不需要進一步稀釋，0.5 mL的樣品體積是令人滿意的。®®
（e） 肉和肉制品中氨的測定。
準確稱取約5 g代表性材料放入100 mL Duran瓶中。添加20 mL 1 M高氯酸并使用Ultra turrax或Polytron均化器（或等效物）均化2分鐘。定量轉(zhuǎn)移至40 mL玻璃燒杯中，并使用2 M KOH將pH調(diào)節(jié)至約8.0。定量轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用蒸餾水調(diào)至刻度（確保含脂層“在”刻度上，水層“在”刻度上）。在冰上儲存20分鐘以沉淀高氯酸鉀，并使脂肪分離。過濾，丟棄前3-5 mL，并使用澄清濾液進行分析。通常，不需要進一步稀釋，0.5 mL的樣品體積是令人滿意的。®®®
（f） 甘草制品中氨的測定。使用杵和研缽使約3g樣品均勻化，并準確稱取約1g代表性材料至100ml容量瓶中。加入60毫升蒸餾水，在70℃下孵育10分鐘，或直至完全溶解。使其平衡至室溫，并用蒸餾水填充至標記處。過濾并使用略帶顏色的濾液進行分析。通常，不需要進一步稀釋，0.5 mL的樣品體積是令人滿意的。
（g） 水中氨的測定（如游泳池水）。
水的氨濃度通常可以不經(jīng)任何樣品處理而測定。一般情況下，不需要稀釋，需要2.0 mL的樣品體積。
標簽：
氨測定試劑盒（快速）
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com