Megazyme方法β‑葡聚糖檢測試劑盒使用說明書
引言
一段時間以來，釀造、食品和配料行業(yè)已經(jīng)確定需要開發(fā)一種準確、方便和可靠的方法來檢測大麥、麥芽、麥芽汁和啤酒中混合糖苷鍵的 β‑葡聚糖。Megazyme方法滿足所有這些要求。它使用簡單，一天可以檢測 50‑100 個樣本。該方法還適用于燕麥和燕麥纖維產(chǎn)品中 β‑葡聚糖的檢測（改進型方法，第 5 頁）。
反應原理
將樣品置于 pH 6.5 的緩沖溶液中懸浮和水合，然后與純化的地衣聚糖酶一起孵育并過濾，之后用純化的 β‑葡糖苷酶將等分的濾液水解至完全，最后使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑測定產(chǎn)生的 D‑葡萄糖。
將樣品置于 pH 6.5 的緩沖溶液中懸浮和水合，然后與純化的地衣聚糖酶一起孵育并過濾，之后用純化的 β‑葡糖苷酶將等分的濾液水解至完全，最后使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑測定產(chǎn)生的 D‑葡萄糖。
準確性
在我們的實驗室中，燕麥和大麥樣品測試的標準誤差通常為± 3%。
評估
精簡的 β‑葡聚糖方法已被 AOAC 國際（方法 995.16）、AACC（方法 32‑23.01）和 ICC（方法 166）成功評估。該方法的原始版本也成功地通過了澳大利亞皇家化學研究所分析委員會以及歐洲釀造公約的評估。
特異性
該測定對混合鍵 [(1‑3)(1‑4)]‑β‑D‑葡聚糖具有特異性。
試劑盒
Megazyme 提供可進行 100 次檢測的試劑盒。該試劑盒包含完整的檢測方法以及：
瓶 1：地衣聚糖酶 [特異性，內(nèi)切‑(1‑3)(1‑4)‑β‑D‑葡聚糖 4‑葡聚糖水解酶] 懸浮液 (1 mL)。在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 3 年以上。
瓶 2：β‑葡萄糖苷酶 (1 mL) 懸浮液。在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 3 年以上。
瓶 3：GOPOD 試劑緩沖液。緩沖液（50 mL，pH 7.4），含對羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09% w/v）。在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 4 年以上。
需要的設備
瓶 4：GOPOD 試劑酶。含葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和 4-氨基安替比林。凍干粉。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 4 年以上。
瓶 5：D-葡萄糖標準溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶劑為 0.2% (w/v) 苯甲酸。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
瓶 6：標準化大麥粉質控樣。小瓶標簽上顯示的是 β‑葡聚糖含量。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
瓶 7：標準化燕麥粉質控樣。小瓶標簽上顯示的是 β‑葡聚糖含量。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
試劑/懸液的制備：
1. 用 20 mM 磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）將瓶 1（地衣聚糖酶）的內(nèi)容物稀釋至 20.0mL，將其等分后儲存于聚丙烯管中，在低于‑10°C 可保存 2 年以上。使用期間需盡可能保持低溫。
注：該酶不得與 β‑葡萄糖苷酶發(fā)生交叉污染。
2. 用 50 mM 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）將瓶 2（β‑葡萄糖苷酶）的全部內(nèi)容物稀釋至 20.0 mL，將其等分后儲存于聚丙烯管中，在低于‑10°C 可保存 2 年以上。
使用期間需盡可能保持低溫。
3. 將瓶 3（GOPOD 試劑緩沖液）用去離子水定容至 1L，配制完成后立即使用。
注：
（1）儲存時，濃縮緩沖液中可能會形成鹽晶體。當該緩沖液用去離子水稀釋至 1L時，它們必須完全溶解。
（1）儲存時，濃縮緩沖液中可能會形成鹽晶體。當該緩沖液用去離子水稀釋至 1L時，它們必須完全溶解。
（2）該緩沖液含有 0.09% (w/v) 疊氮化鈉。這是一種有毒化學品，配制時請做好安全防
護。
4. 先將瓶 4 中的內(nèi)容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再將其和剩余的溶液 3 混勻。
用鋁箔紙將試劑瓶包裹以避光放置。此試劑稱之為為葡萄糖測定試劑(GOPODReagent)。在 2-5°C 下可穩(wěn)定儲存約 3 個月。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 12 個月以上。
注：
（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲存，最好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用過程中僅冷凍/解凍一次。
（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲存，最好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用過程中僅冷凍/解凍一次。
（2）新配制的試劑可能呈淡黃色或淡粉色。在 4°C 儲存的 2-3 個月內(nèi)，溶液顏色會逐漸轉變?yōu)楦畹姆奂t色，但不影響使用。
試劑配制（本試劑盒不提供）
試劑 1 磷酸鹽緩沖液 (20mM，pH 6.5)
將 3.12 g 二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)溶解在 900 mL 蒸餾水中，通過加入100 mM 氫氧化鈉(4 g/L)(大概需要 50 mL)調節(jié) pH，并定容至 1L，最后加入疊氮化鈉 0.2 g。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 2 個月。
試劑 2 醋酸鈉緩沖液 (50mM，pH 4.0)
將 2.9mL 的冰醋酸添加到 900mL 蒸餾水中。通過添加 1M (40g/1L)氫氧化鈉溶液將 pH 值調節(jié)至 4.0，定容至 1L。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 2 個月。
試劑 3 醋酸鈉緩沖液 (200mM，pH 4.0)
將 11.6mL 的冰醋酸添加到 900mL 蒸餾水中。通過添加 1M (40g/1L)氫氧化鈉溶液將 pH 值調節(jié)至 4.0，定容至 1L。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 2 個月。
需要的設備
1. 帶蓋的聚丙烯管/容器（35 mL 容量）
2. 玻璃試管（12 mL 容量）
3. 移液槍，例如 Gilson Pipetman® (100 μL 和 200 μL)
4. 容積式移液器，例如帶有 5.0mL 注射器吸嘴的 Eppendorf Multipette®
5. 可調節(jié)容量分配器：
⚫ 0‑5.0 mL（用于磷酸鹽緩沖液）
⚫ 3.0 mL（用于葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑）
⚫ 0‑25.0 mL（蒸餾水）
6. 實驗室烘箱
7. 分析天平
8. 分光光度計（可設置 510nm）
9. 渦旋混合器
控制和預防措施
操作流程
10. 恒溫水浴鍋（設置為 50°C，或根據(jù)第 10 頁原始版本中的方法設為 40°C）
11. 計時器
12. Whatman No.41 濾紙
13. 離心機(可用于麥芽，麥芽汁和啤酒的制備)。
14. 帶 0.5mm 篩網(wǎng)的實驗室用研磨機（例如 Frisch pulverisette 14®）
15. 沸水浴裝置
控制和預防措施
1.每組測定均包含 100 µg 的空白試劑和 D‑葡萄糖標準品，一式兩份�？瞻自噭┌� 0.1 mL 蒸餾水 + 0.1 mL 醋酸鈉緩沖液 + 3.0 mL GOPOD 試劑。
葡萄糖標準品包括 0.1 mL 醋酸鈉緩沖液 + 0.1 mL D‑葡萄糖標準品 (100 µg/0.1mL) + 3.0 mL GOPOD 試劑。
2. 每組至少測定一個大麥質控樣。
3. 每批新的 GOPOD 試劑均應檢查 100 µg D‑葡萄糖標準品的最大顯色時間，這通常大約為 15 分鐘。
4. 地衣聚糖酶不能與 β‑葡萄糖苷酶制劑交叉污染。
操作流程
(a) 燕麥、大麥粉和纖維樣品的測定程序 ‑ 簡化方法（AOAC 方法 995.16、AACC 方法 32‑23 和 ICC 標準方法 No. 166）
該程序適用于所有干燥樣品，尤其是那些含有高水平 β‑葡聚糖的樣品（例如加工過的燕麥麩產(chǎn)品）。
1. 使用 Fritsch pulverisette 14® (Fritsch GmbH Idar Oberstein, Germany)或類似的離心磨將大麥、燕麥或纖維樣品（約 50 克）磨碎以通過 0.5 毫米篩網(wǎng)。
2. 將面粉樣品（80‑120 mg；準確稱重）加入玻璃試管（16 x 120 mm；17 mL 容量）中，輕敲試管以確保所有樣品都落到試管底部。
3. 用 0.2 mL 乙醇水溶液 (50% v/v) 潤濕樣品，加入磷酸鈉緩沖液（4.0 mL，20mM，pH 6.5），渦旋混勻。
4. 混勻后，立即將試管放入沸水浴中孵育 60 秒。在渦旋混合器上劇烈攪拌混合物，在 100°C 下再孵育 2 分鐘并再次攪拌。
5. 將試管和內(nèi)容物在 50°C 水浴鍋中孵育 5 分鐘。
6. 加入地衣聚糖酶（0.2 mL，10 U）并攪拌試管內(nèi)容物。用封口膜封住試管，將其置于 50℃水浴鍋中孵育 1 小時，在旋渦攪拌器上進行有規(guī)律的劇烈攪拌 3-4次。連續(xù)攪拌設備推薦：Megazyme Multi-stir IncubationBath (Cat. no. D-IBMKIII)。
7.加入醋酸鈉緩沖液（5.0 mL，200 mM，pH 4.0），在渦旋混合器上劇烈混合試管內(nèi)容物。
8.讓試管溫度平衡至室溫（約 5 分鐘）并離心（1,000 g 離心力，10 分鐘）。使用Gilson Pipetman®或 Rainin EDP‑2®將等分試樣 (0.1 mL) 小心準確地分配到三個試管（容量為 12 mL）的底部。
9.將 溶解于 50 mM 醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0) 中的 β‑葡萄糖苷酶 (0.1 mL, 0.2 U)添加到其中兩個試管中（反應組）。向第三個試管中（空白組）添加 50 mM 醋酸鈉緩沖液（0.1 mL，pH 4.0）。將所有試管在 50°C 下孵育 10 分鐘。
10.在各試管中加入 3.0mLGOPOD 試劑，混勻后在 50°C 水浴中孵育 20min。
11.從水浴中取出試管，冷卻后在 1h 內(nèi)于 510nm 處測量溶液吸光度（以空白溶液為參照）。
注意：試管中存在的 D‑葡萄糖量（即在被分析的 0.1 mL 樣品中）應在 4 到 100μg之間。 β‑葡萄糖苷酶處理前的樣品溶液必須用 200 mM 醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0)充分稀釋，以使糖濃度在 0.04 和 1.0 g/L 之間，約相當于原始樣品中 0.35% 和8.5% 的 β‑葡聚糖。例如，如果樣品中含有 20%的 β‑葡聚糖，則應先用 200 mM醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）將其稀釋 3 倍，然后再進行分裝，與 β‑葡萄糖苷酶一起孵育。
或者，對于含有高 β‑葡聚糖的樣品，例如 Oatwell（β‑葡聚糖含量> 50%），樣品量應減少至 50 mg，體積應在地衣聚糖酶處理后用 200 mM 醋酸鈉緩沖液（pH4.0）調整至 100 mL。
（b) 煮熟、烘烤或擠壓谷物產(chǎn)品的測定程序 ‑ 簡化方法（AOAC 方法 995.16、AACC 方法 32‑23 和 ICC 標準方法 166）
在分析煮熟、烘烤或擠壓谷物產(chǎn)品中的 β‑葡聚糖時，應使用乙醇水溶液對樣品進行預提取，以去除游離糖并降低脂肪和油的含量。
1. 使用 Fritsch pulverisette 14® (Fritsch GmbH Idar Oberstein, Germany)或類似的離心磨將食品（約 50 克）磨碎以通過 0.5 毫米篩網(wǎng)。
2. 將樣品（約 200mg；準確稱重）加入玻璃試管（16 x 120 mm；17 mL 容量）中，輕敲試管以確保所有樣品都落到試管底部。
3. 加入 5.0 mL 乙醇水溶液 (50% v/v)，將試管置于沸水浴中孵育 5 分鐘。在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物后，再加入 5.0 mL 50% (v/v) 乙醇水溶液，混合均勻。
4. 以 1,800 g（約 3,000 rpm）離心 10 分鐘，棄去上清液。
5. 將沉淀重懸于 5.0 mL 的 50% (v/v) 乙醇水溶液中，并在渦旋混合器上攪拌。再加入 5.0 m 的 50% 乙醇水溶液。在渦旋混合器上攪拌后，離心并棄去上清液（同步驟 4）。
6. 將沉淀懸浮在 4.0 mL 磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5）中，將試管在 50°C水浴鍋中孵育 5 分鐘。
7. 加入地衣聚糖酶（0.2 mL，10 U）并攪拌試管內(nèi)容物。用封口膜封住試管，將其置于 50℃水浴鍋中孵育 1 小時，在旋渦攪拌器上有規(guī)律的劇烈攪拌 3-4 次。
連續(xù)攪拌設備推薦：Megazyme Multi-stir IncubationBath (Cat. no. D-IBMKIII)。
8.加入醋酸鈉緩沖液（2.0 mL，200 mM，pH 4.0），在渦旋混合器上劇烈混合試管
內(nèi)容物。
9. 從方法（a）中步驟 8 開始，剩余步驟與其一致。
(c) 奶昔、酸奶和其他液體樣品（乙醇沉淀）的測定程序
1. 準確稱量玻璃離心管（16 x 120 mm；17 mL 容量）。
2. 向試管中加入 3.0 mL 樣品，在沸水浴中加熱 5 分鐘。讓其冷卻至室溫。
3. 向試管中加入 3.0 mL 乙醇水溶液 (95% v/v)，在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物后，再加入 5.0 mL 95% (v/v) 乙醇水溶液，在渦旋攪拌器上混合均勻。
4. 以 1,800 g（約 3,000 rpm）離心 10 分鐘，棄去上清液。
計算（固體樣品）
5. 將沉淀重懸于 8.0 mL 的 50% (v/v) 乙醇水溶液中并在渦旋混合器上攪拌，離心并棄去上清液（同步驟 4）。
6. 將沉淀懸浮在 4.0 mL 磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5）中，將體積調整至 4.0mL（按重量計），將試管在 50°C 水浴鍋中孵育 5 分鐘。
7. 從方法（a）中步驟 6 開始，剩余步驟與其一致。
注意：如果樣品吸光度值超過葡萄糖標準品的吸光度值，則必須用 200mM 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）稀釋樣品，以便在分配等分試樣與 β‑葡萄糖苷酶孵育之前使其處于合適的濃度范圍內(nèi)。
計算（固體樣品）
其中：
ΔA = β‑葡萄糖苷酶處理后的吸光度減去空白樣品溶液的吸光度
F = 將吸光度值轉換為葡萄糖 μg 量的轉換系數(shù)
=
100（D−葡萄糖的 μg 量）
100μgD−葡萄糖的吸光度
FV =最終體積（即，對于示例 (A) 中的燕麥和大麥粉為 9.4 mL；對于示例 (B)中煮熟、烘烤和擠壓的谷物產(chǎn)品，為 6.4 mL；對于含有 > 50% β‑葡聚糖的樣品，為 100mL，見第 6 頁注解）。
0.1 = 分析的樣品量。
1/1000 = 從 μg 轉換為 mg。
100/W = 以 β-葡聚糖含量占樣品重量的百分比為因子。
W = 所分析樣品的重量(以 mg 為單位)。
162/180 = 從確定的游離 D-葡萄糖轉化為脫水-D-葡萄糖的因子，如在 β-葡聚糖中發(fā)生的一樣。
D = 在與 β‑葡萄糖苷酶孵育之前進一步稀釋（如果需要）
計算（液體樣品；g/100 mL）
其中：
ΔA = β-葡萄糖苷酶處理后吸光度(反應)減去空白試劑的吸光度。
F = 將吸光度值轉換為葡萄糖 μg 量的轉換系數(shù)
=
100（D−葡萄糖的 μg 量）
100μg D−葡萄糖的吸光度
9.2/3.0 = 體積校正因子:3.0 mL 樣品用 IMS 處理，體積調整為 9.2 mL)(如 4.0 mL + 0.2 mL 地衣聚糖酶+ 5.0 mL 醋酸緩沖液)。
1000 = 體積調節(jié)因子(檢測 0.1 mL，但結果以每 100 mL 樣品表示)。
1/1000 = 從 μg 轉換為 mg。
1/1000 = 從 mg 轉換為 g。
162/180 = 從確定的游離 D-葡萄糖轉化為脫水-D-葡萄糖的因子，如在 β-葡聚糖中發(fā)生的一樣。
D = 在與 β‑葡萄糖苷酶孵育之前進一步稀釋（如果需要）。
注意：使用 Megazyme 的 Mega-CalcTM 可以簡化這些計算，可在 Megazyme 網(wǎng)站上下載(www.megazyme.com)。
(d) 歐洲釀造公約批準的大麥檢測程序（EBC 方法 3.10.1）
有用的提示：
1. 用地衣聚糖酶孵育樣品后，建議通過分配器加入 24.0 mL 蒸餾水，將反應混合物* 的體積調整至 30.0 mL。
* 假設體積為 6.0 mL；大約在加熱步驟中損失了 0.2 mL。
2. 在測定程序的第 5 步中，如果溶液在沸騰 5 分鐘后變得非常粘稠，加入 5.0mL 蒸餾水并在渦旋混合器上充分攪拌。與地衣聚糖酶反應后，加入 19.0 mL 蒸餾水，將體積調節(jié)至 30.0 mL。
注意：如果溶液非常粘稠，隨著地衣聚糖酶的擴散，可能會出現(xiàn)一些問題。加入 5.0 mL蒸餾水可緩解這個問題。
3. 如果在步驟 5 中使用玻璃管而不是聚丙烯管，在測定過程中，首先將在沸水浴中的孵育時間減少到 45 秒，渦旋內(nèi)容物然后在沸水浴中再孵育 45 秒（即總共 1.5 分鐘）。
方法：
1. 使用 Tecator Cyclotec® 研磨機碾磨大麥以通過 0.5 mm 的篩網(wǎng)（均勻、精細的研磨是必不可少的）。
2. 將已知水分含量的大麥面粉樣品(約 0.5 克)準確稱重，放入聚丙烯管中(參見設備，第 3 頁，第 1 點)。
*參見第 11 頁“示例結果表”下的腳注。
3. 在每個試管中加入等分試樣 (1.0 mL) 的乙醇水溶液 (50% v/v)，以分散樣品。
4. 加入 5.0 mL 磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5），使用渦旋混合器攪拌試管。
5. 試管在沸水浴中孵育大約 2 分鐘(參見有用的提示的第 2 點和第 3 點)。取出試管，在旋渦攪拌器上用力攪拌。在沸水浴中再加熱 3 分鐘(2 分鐘后混合防止形成凝膠塊)
6. 將試管冷卻至 40°C，并在每個試管中加入 0.2 mL 地衣聚糖酶 (10 U)。蓋上試管蓋，攪拌并在 40°C 下孵育 1 小時。
7. 通過添加蒸餾水將每管中的體積調整到 30.0 mL(參見有用的提示的第 1 點)。
8. 徹底混合管中的內(nèi)容物，通過 Whatman No. 41 濾紙過濾從每個試管中分離出來的混合物(或以大約 1000g 的離心力離心 10 分鐘)。
9. 小心準確地從每個濾液中轉移等分試樣(0.1 mL)到三個試管的底部。
10. 在其中一個(空白組)中加入 0.1 mL 的醋酸鈉緩沖液(50 mM, pH 4.0)，在另兩個(反應組)中加入 0.1 mL 用 50 mM 醋酸緩沖液(pH 4.0)稀釋的 β-葡萄糖苷酶(0.2U)。40°C 下孵育 15 分鐘。
11. 每管加入 3.0 mL GOPOD 試劑，在 40°C 下孵育 20 分鐘(見第 4 頁，控制和預防措施中的第 3 點)。
12. 測量每個反應組(EA)和空白組 (EBl)在 510 nm 處的吸光度。
注意:本試劑盒使用的 GOPOD 試劑，形成的顯色配合物在室溫下至少能穩(wěn)定 2小時。
結果示例表:
麥糟:
啤酒或麥芽汁（EBC 方法 8.13.1）：
干重=鮮重 x（100-水分含量%）* /100
*
一般來說，這是由近紅外反射率決定的。另外，這也可以通過觀察面粉樣品(0.5 g)在 80℃下存放 20 小時的質量下降情況來確定。谷物面粉樣品的水分含量始終保持在 10-14%的范圍內(nèi)(e) 歐洲釀酒公約認可的麥芽、麥糟、啤酒和麥芽汁的檢測程序
麥芽（EBC 方法 4.16.1）：
1. 加入 1.0 g 麥芽粉(研磨至通過 0.5 mm 篩)或在麥芽制造過程中除去的凍干大麥樣品，加入 5.0 mL 乙醇(50% v/v)。
2. 在沸水浴中孵育 5 分鐘后，在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物，再加入 5.0 mL的 50% (v/v) 乙醇水溶液，混合。
3. 以 1,000 g 的離心力離心 10 分鐘，棄去上清液。
4. 將沉淀重懸于 10.0 mL 50% (v/v) 乙醇水溶液中，離心并棄去上清液（如上述步驟 3）。
5. 將顆粒懸浮在 5.0 mL 磷酸鈉緩沖液中(20 mM, pH 6.5)。
6. 從大麥測定流程中步驟 5 開始，剩余步驟與其一致。
麥糟:
用熱水(約 75°C)清洗麥糟，然后凍干，或不清洗凍干。將該材料磨碎至通過 0.5 mm 的篩，分析 β-葡聚糖含量，之后使用與麥芽樣品相同的程序進行計算。
啤酒或麥芽汁（EBC 方法 8.13.1）：
1. 在沸水浴中加熱啤酒各等分試樣至約 80°C 來脫氣，之后讓其冷卻。
2. 在預先稱重的離心管(容量為 12 mL)中加入 5.0mL 麥芽汁或脫氣啤酒，再加入 2.5 克精細研磨的硫酸銨晶體。
3. 用 Parafilm®密封試管，小心的上下倒置以溶解硫酸銨(避免起泡)。
4. 讓試管靜置，然后在 4°C 下放置 20 小時。
5. 以 1,000 g 的離心力離心 10 分鐘。
6. 棄去上清液。
7. 用 1.0 mL 50% (v/v)乙醇水溶液重懸顆粒，并完全渦旋。再加入 10.0 mL的 50% (v/v)乙醇，通過試管來回倒置混合均勻。
8. 以 1,000 g 的離心力離心 5 分鐘，棄去上清液。
9. 重復上述步驟 7 和 8 中的乙醇洗滌程序，重新懸浮顆粒。
10. 棄去上清液。
注：對于含有低水平 β-葡聚糖的麥芽汁樣品，請用 β-葡萄糖苷酶孵育較大等份的樣品溶液（最多 0.5 mL）， 對空白組也應使用這個更大的等份容量。同時，D-葡萄糖標準液也必須用蒸餾水進行相應調整，并相應地修改計算。
計算:
11. 將顆粒重新懸浮在磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5）中：對于麥芽汁，將
體積調整到 4.8 mL（按重量計）；對于啤酒，將體積調整到 1.8 mL（按重量計）。
12. 加入 0.2 mL 地衣聚糖酶 (10 U) 并在 40°C 下孵育 5 分鐘。以 1,000 g 的離心力離心 10 分鐘，從大麥測定流程中步驟 9 開始，剩余步驟與其一致。
注：對于含有低水平 β-葡聚糖的麥芽汁樣品，請用 β-葡萄糖苷酶孵育較大等份的樣品溶液（最多 0.5 mL）， 對空白組也應使用這個更大的等份容量。同時，D-葡萄糖標準液也必須用蒸餾水進行相應調整，并相應地修改計算。
計算:
對于大麥、麥芽和麥糟：
對于麥芽汁
對于啤酒：
不同方法的比較
其中：
ΔA = β-葡萄糖苷酶處理后的吸光度(反應)減去空白試劑的吸光度。
F = 將吸光度值轉換為葡萄糖 μg 量的轉換系數(shù)
=100（D−葡萄糖的 μg 量）/100μg D−葡萄糖的吸光度
300=容積校正（如從 30.0mL 中取 0.1mL）
10000=容積校正系數(shù)（分析了 0.1 mL，但結果顯示為每升樣品）
1/1000 = 從 μg 轉換為 mg。
100/W = 以 β-葡聚糖含量占干面粉重量的百分比為因子。
W = 所分析樣品的重量，以 mg 為單位（請參閱第 6 頁的示例結果表）。
5/5=體積校正因子。對于麥芽汁樣品，5.0 mL 的等分樣液用沉淀劑(硫酸銨)處理，體積調整為 5.0 mL(即 4.8 mL + 0.2 mL 地衣聚糖酶)。
2/5=體積校正因子。對于啤酒樣品，5.0mL 的等分樣液用沉淀劑(硫酸銨)處理,體積調整為 2.0 mL(即 1.8mL+ 0.2mL 地衣聚糖酶)。
162/180 = 從確定的游離 D-葡萄糖轉化為脫水-D-葡萄糖的因子，如在 β-葡聚糖中發(fā)生的一樣。
注意:使用 Megazyme 的 Mega-CalcTM 可以簡化這些計算，可在 Megazyme 網(wǎng)站上下載(www.megazyme.com)。
不同方法的比較
在實驗室間的評估中，已將 Megazyme 改進型 β-葡聚糖方法與 AACC 方法32-22（原始 Megazyme 方法的 AACC 修改）1 進行了比較，兩種方法獲得的結果非常相似。 Megazyme“改進型方法”的結果如表 1 所示。
使用這種方法，一個分析人員一天可以分析 100 多個樣品。與之相比，使用AACC 方法 32-22 ，只能分析大約 20 個樣品。
表 1：采用改進型酶法測定燕麥中 β-D-葡聚糖的方法性能. a
a
基于 8 個實驗室的結果； 未發(fā)現(xiàn)異常值
b
r = 2.8 x sr
c
R = 2.8 x sR
酶活性的標準化：
使用對硝基苯基 β-葡萄糖苷作為底物對 β-葡萄糖苷酶進行標準化。一個單位定義為在 pH 4.0 和 40°C 條件下每分鐘從對硝基苯基 β-葡萄糖苷 (10 mM) 中釋放 1 微摩爾對硝基苯酚所需的酶量。使用 Nelson/Somogyi 還原糖程序，在 40°C的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.5) 中測定大麥 β-葡聚糖 (10 mg/mL) 的地衣聚糖酶活性。一單位活性定義為在規(guī)定的測定條件下，每分鐘釋放 1 微摩爾 D-葡萄糖還原糖當量所需的酶量。
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