β-葡聚糖（酵母和蘑菇）含量檢測試劑盒使用說明書
產(chǎn)品介紹：
重要信息：
本檢測程序已于 2023 年 8 月更新（檢測程序 08/23），在檢測試劑中增添了海藻糖酶懸浮液（7 號瓶）。在檢測程序的第二部分（測定 α-葡聚糖）添加海藻糖酶可提高含海藻糖（α-D-吡喃葡糖基-（1,1）-α-D-葡萄糖苷）樣品的 α-葡聚糖測量值。因此，計(jì)算出的 β-葡聚糖含量會下降。所有樣品類型都應(yīng)遵守更新后的檢測程序。
（1-3）-β-葡聚糖廣泛存在于自然界中，在藻類、真菌和酵母中尤為多見，也存在于高等植物中。β-葡聚糖具有多種生物學(xué)功能：是細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分，可作為碳水化合物貯藏，在有些情況下，受到刺激（例如，創(chuàng)傷）的部位也可能合成 β-葡聚糖，以發(fā)揮保護(hù)作用 1。
中醫(yī)在數(shù)百年前就已認(rèn)識到許多蘑菇的藥用功效，并將其入藥。最近有研究1-7證明，蘑菇中的關(guān)鍵活性物質(zhì)是三萜類化合物、麥角固醇，以及最重要的1,3:1,6-β-葡聚糖。這類 β-葡聚糖能夠激活免疫系統(tǒng)，甚至可能具有抗癌功效 1-7。
監(jiān)管機(jī)構(gòu)對這類營養(yǎng)補(bǔ)充劑的健康聲稱以及相關(guān)產(chǎn)品的標(biāo)識和純度表示擔(dān)憂 8，尤其令人擔(dān)憂的藥用菌產(chǎn)品。相關(guān)研究已確定藥用菌的關(guān)鍵活性成分為1,3:1,6-β-葡聚糖、三萜類化合物和麥角固醇。
目前已有研究對多種蘑菇的 1,3:1,6-β-葡聚糖成分進(jìn)行相當(dāng)詳細(xì)的研究，并確認(rèn)其最主要的結(jié)構(gòu)特征是以 1,3-β-葡聚糖為主鏈，以 1,6-β-葡聚糖為支鏈，且主鏈上的每 3 個(gè) 9 或 4 個(gè) D-葡萄糖殘基連接一條 1,6-β 支鏈。但也有研究報(bào)告了更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu) 10-14。蘑菇和真菌 β-葡聚糖與谷物 β-葡聚糖（所謂的混聯(lián) β-葡聚糖）的結(jié)構(gòu)差異非常大。谷物 β-葡聚糖是線性多糖，其中 D-葡萄糖殘基通過 1,3-β和 1,4-β 糖苷鍵連接，而且這兩種連接鍵的比例因 β-葡聚糖的來源（例如，燕麥、大麥和小麥）而異。其他類型的 β-葡聚糖包括纖維素（1,4-β-D-葡聚糖）和凝膠多糖（1,3-β-D-葡聚糖）。已有研究說明用于測定谷物 1,3:1,6-β-葡聚糖的高度特異性酶法檢測程序 15,16。紐勤提供基于這種方法的檢測試劑盒：β-葡聚糖檢測試劑盒（混聯(lián)）（K-BGLU）。
商用酵母產(chǎn)品中描述了 1,3:1,6-β-葡聚糖的酶法檢測程序 17,18（包括紐勤的酵母 β-葡聚糖酶法檢測試劑盒（K-EBHLG）），但是目前尚無研究說明用于定量測定蘑菇子實(shí)體或菌絲體中 β-葡聚糖含量的酶法檢測程序。到目前為止，許多用于測量蘑菇 β-葡聚糖的方法 19,20 都是基于 Prosky21,22 膳食纖維檢測程序改良而來。
本手冊介紹了一種間接測定蘑菇和菌絲體產(chǎn)品、酵母和真菌制劑中1,3:1,6-β-葡聚糖含量的方法 23。本方法使用淀粉葡糖苷酶、蔗糖酶和海藻糖酶水解淀粉、麥芽糊精、蔗糖和海藻糖中的 α-葡聚糖。如果樣品中含有無法被這些酶水解的 α-葡聚糖，則會導(dǎo)致 β-葡聚糖的測定結(jié)果偏高。
本測定程序不適用于在其他 β-葡聚糖存在下的酵母/蘑菇 β-葡聚糖分析，例如纖維素（1,4-β-D-葡聚糖）。
原理：
將 1,3:1,6-β-葡聚糖、1,3-β-D-葡聚糖和 α-葡聚糖溶解于冰冷的 12 M 硫酸（H2SO4）中，然后在 2 M 硫酸中水解至接近完全 24,25。然后使用高純度外切-1,3-β-葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶的混合物將剩余的葡聚糖片段定量水解為葡萄糖。然后使用 GOPOD 試劑測定釋放的 D-葡萄糖。這一步驟測定的是總葡聚糖含量。
淀粉、麥芽糊精、蔗糖和海藻糖中的 α-葡聚糖，通過與淀粉葡糖苷酶、蔗糖酶和海藻糖酶一起孵育水解。然后使用 GOPOD 試劑測定游離的 D-葡萄糖和水解過程中釋放的 D-葡萄糖。
β-葡聚糖含量則為總葡聚糖與 α-葡聚糖的差值，計(jì)算方法如下文所述。
本檢測試劑盒先前的檢測程序采用的是總葡聚糖鹽酸水解法（替代方法）。
關(guān)于檢測程序變更的更多詳細(xì)內(nèi)容可參閱 McCleary 等人 23。
準(zhǔn)確性：
標(biāo)準(zhǔn)誤差通常小于 5%。
安全：
應(yīng)遵守適用于所有化學(xué)物質(zhì)的一般安全措施。關(guān)于安全使用和處理本產(chǎn)品的更多信息，請參閱 Megazyme 網(wǎng)站上提供的相關(guān)安全數(shù)據(jù)表。
試劑盒：
紐勤提供可進(jìn)行 100 次測試的檢測試劑盒。Megazyme 試劑盒包含完整的檢測方法以及：
1 號瓶：（×2）
外切-1,3-β-葡聚糖酶與 β-葡萄糖苷酶硫酸銨懸浮液，2.0 mL。置于 4 °C 保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
外切-1,3-β-葡聚糖酶與 β-葡萄糖苷酶硫酸銨懸浮液，2.0 mL。置于 4 °C 保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
2 號瓶：
以 50%（v/v）丙三醇為溶劑的淀粉葡糖苷酶與蔗糖酶溶液，20mL。置于-10 ℃以下保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。注意：如置于 4 °C 保存，試劑有效期將縮短至 2 年以下。
3 號瓶：
GOPOD 試劑緩沖液。
緩沖液（50 mL，pH 7.4）。對羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09%）。置于 4 °C 保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
4 號瓶：
GOPOD 酶試劑。葡萄糖氧化酶和過氧化物酶，以及 4-氨基安替比林。凍干粉。置于-10 ℃以下保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
5 號瓶：
D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.00 mg/mL），溶于 0.2%（w/v）苯甲酸中。
置于室溫下密封保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
試劑溶液/懸浮液制備：
必要試劑（未提供）：
6 號瓶：
酵母 β-葡聚糖對照試劑（約 2 g，瓶身標(biāo)簽上標(biāo)明 β-葡聚糖含量）。
置于室溫下密封保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
7 號瓶：
海藻糖酶懸浮液（5 mL）。置于 4 °C 保存。有效期限請查看試劑瓶標(biāo)簽。
試劑溶液/懸浮液制備：
1.向 1 號瓶中添加 9 mL 200 mM 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）（即，將 1 號瓶內(nèi)容物稀釋至 11 mL）。得到溶液 1。
將溶液分成體積適當(dāng)?shù)亩喾莸确秩芤�，并儲存于聚丙烯管中。不使用時(shí)置于-10℃以下保存，可穩(wěn)定 2 年以上。使用時(shí)將其置于冰上。僅在需要時(shí)稀釋第二瓶內(nèi)容物。
2. 直接使用 2 號瓶內(nèi)容物。
3.用蒸餾水將 GOPOD 試劑緩沖液稀釋定容至 1 L。得到溶液 2�，F(xiàn)配現(xiàn)用。
注意：
1. 濃縮緩沖液在儲存期間可能會形成鹽晶體。在使用蒸餾水將該緩沖液稀釋至1 L 時(shí)，這些晶體必須完全溶解。
2. 緩沖液中含 0.09%（w/v）疊氮化鈉。疊氮化鈉是一種有毒的化學(xué)物質(zhì)，應(yīng)按照相應(yīng)要求小心處理。
4.用約 20 mL 溶液 2 溶解 4 號瓶內(nèi)容物（GOPOD 酶試劑），并將得到的溶液定量轉(zhuǎn)移至裝有剩余溶液 2 的瓶中。用鋁箔包裹容器，以避免瓶內(nèi)試劑受到光的照射。得到的試劑為葡萄糖測定試劑（GOPOD 試劑）。在 4 ℃下可穩(wěn)定 1 個(gè)月，在-10 °C 以下可穩(wěn)定 12 個(gè)月。
如果 GOPOD 試劑需要冷凍保存，最好是將試劑分為多份等分溶液再進(jìn)行保存。避免反復(fù)凍融。
新配制的溶液可能呈淡黃色或淡粉紅色。置于 4°C 保存時(shí)可能呈深粉紅色。
以蒸餾水為對照，該溶液的吸光度值應(yīng)小于 0.05。
5. 直接使用 5 號瓶內(nèi)容物。
6. 直接使用 6 號瓶內(nèi)容物。
7.直接使用 7 號瓶內(nèi)容物。首次打開瓶蓋前，搖晃瓶身，將沉淀在橡膠瓶塞上的蛋白質(zhì)與溶液混合均勻。隨后，將儲存瓶直立放置。
必要試劑（未提供）：
1. 乙酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）。
將 11.6 mL 冰乙酸（1.05 g/mL）添加至 900 mL 蒸餾水中，并用 4 M（16 g/100mL）氫氧化鈉溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 4.5。定容至 1L。
2. 乙酸鈉緩沖液（1.2 M，pH 3.8）。
將 68.6 mL 冰乙酸（1.05 g/mL）添加至 800 mL 蒸餾水中，并用 4 M 氫氧化鈉將 pH 值調(diào)節(jié)至 3.8。用蒸餾水定容至 1L。
3. 氫氧化鈉（8.0 M）
在通風(fēng)良好的通風(fēng)柜中，將 320 g 氫氧化鈉添加至 700 mL 蒸餾水中，攪拌溶解。將溶液冷卻至室溫，然后定容至 1L。
4. 氫氧化鈉（1.7 M）
將 68 g 氫氧化鈉添加至 800 mL 蒸餾水中，攪拌溶解。定容至 1L。
5. 硫酸（12 M，72% w/w）
在通風(fēng)良好的通風(fēng)柜中，小心地將 640 mL 濃硫酸（98%，比重為 1.835）添加至 300 mL 蒸餾水中。稀釋定容至 1L 并混合均勻。
設(shè)備（推薦）：
1. 玻璃試管（圓底，16×100 mm，14 mL 容量）。
2. 康寧培養(yǎng)管。——螺口試管，20 ×125mm（Fisher Scientific，型號 FB59563）與試管蓋（型號 FB51355）。
螺口試管，16×125 mm（Fisher Scientific，型號 FB59559）與試管蓋（型號FB51354）。
3. 沸水浴裝置。
4. 微量移液器：100 µL（例如 Gilson Pipetman® 或 Rainin EDP-2 ®電動分液器）。
5. 外置活塞式移液器，例如 Eppendorf Multipette® 。
-帶 5.0 mL Combitip®分液管（用于移取 0.1 mL 水解樣品等分溶液和 0.1mL 酶溶液）。
-帶 3 個(gè) 50 mL Combitip®分液管（用于移取 2.0 mL 12 M 硫酸等分溶液、6 mL 8 M 氫氧化鈉等分溶液和 3.0 mL GOPOD 試劑）。
6. 磁力攪拌器與攪拌子（5×15 mm）。
7. 分析天平。
8. 微量離心機(jī)——轉(zhuǎn)速可達(dá) 13000 rpm。
9. 2.0 mL 一次性聚丙烯微量離心管。
10. 分光光度計(jì)（波長設(shè)置為 510 nm）。
11. 溫度設(shè)定為 40 ℃的恒溫水浴裝置。
12. 旋渦混合器。
13. 離心磨碎機(jī)，12 齒轉(zhuǎn)子，篩網(wǎng)孔徑為 1.0 mm。
對照樣品和注意事項(xiàng)：
A. 測定總葡聚糖含量（α-葡聚糖+β-葡聚糖）
B. 測定 α-葡聚糖
式中：
對照樣品和注意事項(xiàng)：
1.本方法不適用于在其他 β-葡聚糖存在下分析酵母/蘑菇 β-葡聚糖，例如纖維素（1,4-β-D-葡聚糖）。
2.如果樣品中含有無法被淀粉葡糖苷酶、蔗糖酶和海藻糖酶水解的 α-葡聚糖，則會導(dǎo)致 β-葡聚糖的測定結(jié)果偏高。
注意：
每組測定至少應(yīng)包含一份酵母或蘑菇對照制劑。也應(yīng)包含試劑空白樣和 100μg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（一式四份）。依照本方法的完整孵育過程，使用 GOPOD 試劑孵育對照樣品和空白樣。
試劑空白樣：0.2 mL 乙酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）+ 3.0 mL GOPOD試劑。
D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：0.1 mL 5 號瓶內(nèi)容物（D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，1 mg/mL）+ 0.1mL 乙酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）+ 3.0 mL GOPOD 試劑。
檢測樣品測得的吸光度不應(yīng)高于 D-葡萄糖對照樣品的吸光度。否則，應(yīng)進(jìn)一步稀釋樣品，以得出適當(dāng)?shù)奈舛取?/span>
測定酵母和蘑菇制劑中的 1,3:1,6-β-葡聚糖含量：
A. 測定總葡聚糖含量（α-葡聚糖+β-葡聚糖）
a. 總葡聚糖的溶解和部分水解
1. 將蘑菇或酵母樣品置于離心磨碎機(jī)中磨碎，直至全部通過孔徑為 1.0 mm 的篩網(wǎng)。
2.將磨碎的樣品（約 90 mg，準(zhǔn)確稱取）添加至一個(gè) 20×12 mm 的 Fisher 品牌培養(yǎng)管中。輕輕敲擊試管壁，確保所有樣品落至管底。
3.向每個(gè)試管中添加 2.0 mL 冰冷的 12 M 硫酸，蓋上管蓋，將試管置于旋渦混合器上劇烈攪拌。將試管置于冰水浴中孵育 2 小時(shí)。定期將試管置于旋渦混合器上劇烈攪拌（多次攪拌，每次 10 至 15 秒）（確保 β-葡聚糖完全溶解）。
4.向每個(gè)試管中添加 4 mL 水，蓋上管蓋，將試管置于旋渦混合器上劇烈攪拌10 秒。然后添加 6 mL 水，蓋上管蓋，再次攪拌 10 秒。
5.松開管蓋，將試管置于沸水�。s 100 ℃）中。5 分鐘后，擰緊管蓋，繼續(xù)孵育 2 小時(shí)。
6.將試管冷卻至室溫，然后小心擰開管蓋。
7.使用一個(gè)裝有 200 mM 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）的水洗瓶，將試管內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至一個(gè) 100 mL 的容量瓶中。每個(gè)試管重復(fù)相同操作。
8. 向容量瓶中添加 6 mL8.0 M 氫氧化鈉溶液，用 200 mM 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）定容至刻度線。顛倒試管，均勻混合內(nèi)容物，并量取等分溶液，轉(zhuǎn)移至微量離心管中。
9. 將等分溶液在 13000 rpm 下離心 5 分鐘。
b. 測定總葡聚糖
1.量取 0.1 mL 過濾或離心萃取液的等分溶液（一式兩份），并將其轉(zhuǎn)移至玻璃
試管（16×100 mm）底部。
2.向每個(gè)試管中添加 0.1 mL 溶液 1 [外切-1,3-β-葡聚糖酶與 β-葡萄糖苷酶]，將
試管置于旋渦混合器上混合均勻，然后置于 40 °C 下孵育 60 分鐘。
3.向每個(gè)試管中添加 3.0 mL GOPOD 試劑，然后置于 40 ℃下孵育 20 分鐘。
4.對照試劑空白樣，測定所有溶液在 510 nm 波長下的吸光度值。
B. 測定 α-葡聚糖
a. α-葡聚糖的溶解、水解和測定
1.將磨碎的樣品（約 100 mg，準(zhǔn)確稱�。┨砑又烈粋�(gè) 20×125 mm 的 Fisher 品牌培養(yǎng)管中。輕輕敲擊試管壁，確保所有樣品落至管底。
2.在每個(gè)試管中放入一個(gè)磁力攪拌子（5×15 mm），然后加入 2 mL 1.7 M 氫氧化鈉溶液。將試管置于冰浴/水浴槽中，并置于磁力攪拌器上攪拌近20分鐘，使顆粒懸浮。
3.向每個(gè)試管中添加 8 mL 1.2 M 乙酸鈉緩沖液（pH 3.8），邊加入邊攪拌。立即添加 0.2 mL 2 號瓶內(nèi)容物[淀粉葡糖苷酶與蔗糖酶]和 0.05 mL 7 號瓶內(nèi)容物[海藻糖酶]，混合均勻，然后將試管置于 40 ℃的水浴槽中。
4.將試管置于 40 ℃下孵育 60 分鐘，期間置于旋渦混合器上間歇攪拌。
5.對于 α-葡聚糖含量高于 10%的樣品：（使用一個(gè)水洗瓶）將試管內(nèi)容物定量轉(zhuǎn)移至一個(gè) 100 mL 的容量瓶中，然后用水定容至刻度線。混合均勻。將等分溶液在 13000 rpm 下離心 10 分鐘，或者用 Whatman 1 號濾紙（9 cm）過濾溶液。
6.對于 α-葡聚糖含量低于 10%的樣品：將 2 mL 溶液轉(zhuǎn)移至微量離心管中，在13000 rpm 下離心 5 分鐘。對于這類樣品，試管內(nèi)的最終體積約為 10.35 mL（然而，不同分析樣品的最終體積可能略有差異）。在有些情況下，計(jì)算時(shí)應(yīng)適當(dāng)考慮溶液體積的差異。
7.將稀釋或未稀釋的上清液的 0.1 mL 等分溶液（一式兩份）轉(zhuǎn)移至玻璃試管（16×100 mm）中，添加 0.1 mL 乙酸鈉緩沖液（200 mM，pH 4.5）和 3.0 mLGOPOD 試劑，然后將試管置于 40 °C 下孵育 20 分鐘。
8.對照試劑空白樣，測定所有溶液在 510 nm 波長下的吸光度值。
注意：
蘑菇和酵母樣品的 α-葡聚糖含量通常低于 10%。然而，一些商用蘑菇菌絲體生長在谷物上，在這種情況下，回收產(chǎn)品的淀粉含量可能高于 75% w/w23。
計(jì)算：
注意：可以使用 Mega-CalcTM 來簡化這些計(jì)算。可訪問 Megazyme 網(wǎng)站（www.megazyme.com）下載 Mega-CalcTM。
式中：
ΔA
=反應(yīng)吸光度值-空白樣吸光度值。
F
=將吸光度值轉(zhuǎn)換為微克 D-葡萄糖的換算系數(shù)。
=100（µg D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品）
100 μg D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的 GOPOD 吸光度值。
100/0.1 =總葡聚糖（酵母）的體積校正系數(shù)（從 100 mL 中量取 0.1 mL）。
103.5 =α-葡聚糖的體積校正系數(shù)（從 10.35 mL 中量取 0.1 mL）。
或者
1000
1000
=α-葡聚糖的體積校正系數(shù)（從 100 mL 中量取 0.1 mL）。
1/1000 =微克至毫克的換算系數(shù)。
100/W =轉(zhuǎn)換為 100 mg 樣品的換算系數(shù)（即，% w/w）。
W
=分析樣品的質(zhì)量。
162/180 =將測定的游離 D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為無水葡萄糖的系數(shù)，如發(fā)生在 β-葡聚糖
中。
標(biāo)簽：
β-葡聚糖（酵母和蘑菇）
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com