淀粉總量檢測試劑盒使用說明書
引言
淀粉大致包含兩種成分，直鏈淀粉主要是通過α-1,4-糖苷鍵連接的 D-葡聚糖，含有極少的 α-1,6 支鏈；而支鏈淀粉中葡萄糖分子之間除了以 α-1,4-糖苷鍵相連外，還有以 α-1,6-糖苷鍵相連的分支結(jié)構(gòu)。淀粉的酶解法主要是將淀粉置于高溫下，通過耐熱α-淀粉酶進(jìn)行糊化，以產(chǎn)生一系列直鏈和支鏈糊精，隨后用淀粉葡糖苷酶（AMG）定量水解為葡萄糖。在 ATP 和 NADP+ 存在下，使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶 (GOPOD) 試劑或己糖激酶/磷酸葡萄糖脫氫酶檢測釋放的葡萄糖。在一系列成功研究的基礎(chǔ)上，該方法被采用為 AOAC 方法 996.11、AACC國際方法 76-13.01 和 ICC 方法 168。
本試劑盒在 AOAC 方法 996.11 的基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)?shù)膬?yōu)化，從而提供了一個更加方便用戶的淀粉檢測方法，即快速總淀粉檢測法(RTS)(圖 1)[程序(a)]。
圖 1 快速總淀粉檢測法(RTS) [程序(a)]
本試劑盒可用來檢測各種食品、飼料、植物和谷物產(chǎn)品（天然或加工）中的總淀粉含量。對于大多數(shù)樣品（例如小麥粉），在耐熱 α-淀粉酶存在的情況下，淀粉能在約 100 ℃的孵育過程中完全溶解。含有高水平抗性淀粉（例如高直鏈玉米淀粉）的樣品則需要在 1.7 M 的冷 NaOH 或熱的 DMSO 中預(yù)溶解。對于僅含有可溶性淀粉或麥芽糊精的樣品，不需要用耐熱α-淀粉酶進(jìn)行孵育。
反應(yīng)原理
耐熱 α-淀粉酶將淀粉水解成可溶性的帶支鏈/不帶支鏈的麥芽糖糊精 (1)。
必要時，可通過用冷的 1.7 M NaOH 攪拌來預(yù)溶解樣品中的抗性淀粉，然后用乙酸鈉緩沖液中和，用 α-淀粉酶水解(2)。
另外，在 100°C 的 DMSO 中進(jìn)行溶解也是有效的方法。
淀粉葡萄糖苷酶 (AMG) 可將麥芽糊精定量水解為 D-葡萄糖 (3)。
D -葡萄糖氧化為 D -葡萄糖酸，釋放等摩爾量的過氧化氫(H2O2)，該反應(yīng)在含過氧化物酶和醌亞胺染料的比色反應(yīng)中可定量檢測（4, 5）。
單個樣品的分析可以在 70 分鐘內(nèi)完成，20 個樣品可以在 2 小時內(nèi)完成。
特異性、靈敏度、線性和精密度
特異性、靈敏度、線性和精密度
該試劑盒對 α-葡聚糖（包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麥芽糊精）具有特異性。
該試劑盒的最小吸光度差異為 0.010 單位。 根據(jù)推薦的總淀粉 (RTS) 方法，使用 100 mg 的樣品重量和 10.2 mL 的提取體積，這相當(dāng)于約 0.09 g/100 g 的總淀粉含量。檢出限為 0.18 g/100 g 總淀粉，即樣品質(zhì)量為 100 mg，提取體積為10.2 mL 時，吸光度差異為 0.020。該方法在每次檢測 4-100 μg D -葡萄糖范圍內(nèi)時呈線性關(guān)系。
干擾
如果 D-葡萄糖的轉(zhuǎn)化在測試規(guī)定的時間內(nèi)（約 20 分鐘）完成，一般可以認(rèn)為沒有發(fā)生干擾。
試劑盒
Megazyme 提供對總淀粉含量進(jìn)行 50/100 次檢測的試劑盒。該試劑盒包含完整的檢測方法以及：
瓶 1：耐熱 α-淀粉酶（Megazyme 貨號：E-BSTAA。pH 6.5，40°C，3,000 U/mL；pH 5.0，40°C，3,000 U/mL），在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 4 年以上，在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。
K-TSTA-50A: 5 mL
K-TSTA-100A: 10 mL
瓶 2：淀粉葡萄糖苷酶（Megazyme 貨號：E-AMGDF。pH 4.5，40°C 時，底物為可溶性淀粉，酶活為3300 U/mL；底物為對硝基苯-β-麥芽糖苷，酶活為200 U/mL），在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 4 年以上，在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。
K-TSTA-50A: 5 mL
K-TSTA-100A: 10 mL
瓶 3：GOPOD 試劑緩沖液。緩沖液（50 mL，pH 7.4），含對羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09% w/v）。在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 4 年以上。
瓶 4：GOPOD 試劑酶。含葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和 4-氨基安替比林。凍干粉。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 4 年以上。
瓶 5：D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶劑為 0.2% (w/v) 苯甲酸。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
瓶 6：標(biāo)準(zhǔn)化常規(guī)玉米淀粉質(zhì)控樣。小瓶標(biāo)簽上顯示的是淀粉含量。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
A. 試劑/懸液的制備：
3. 將瓶 3（GOPOD 試劑緩沖液）用去離子水定容至 1L，配制完成后立即使用。
4. 先將瓶 4 中的內(nèi)容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再將其和剩余的溶液 3 混勻。用鋁箔紙將試劑瓶包裹以避光放置。此試劑稱之為為葡萄糖測定試劑(GOPOD Reagent)。在 2-5°C 下可穩(wěn)定儲存約 3 個月。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 12 個月以上。
5＆6. 瓶 5、瓶 6 中的內(nèi)容物可直接使用。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
B. 試劑配制（本試劑盒不提供）
試劑 4 NaOH 溶液 (1.7M)將 68g NaOH 添加到 900mL 去離子水中并攪拌溶解，定容至 1L。儲存在密封容器中。在室溫下可穩(wěn)定儲存 2 年以上。
試劑 5 含氯化鈣（5mM）和疊氮化鈉（0.02%w/v）的 MOPS 緩沖液 (50mM，pH 7.0)
注意:待 pH 值調(diào)整完成后再加疊氮化鈉。疊氮化鈉酸化時會釋放出有毒氣體。
試劑 6 乙醇（50%和 80% v/v）50%v/v：將 500mL 乙醇(95%v/v)添加到 500mL 蒸餾水中。
D. 控制和預(yù)防措施
4. 使 用 HandyStep® 移液器 [C(l)] ， 將 0.1mL 未稀釋的耐熱 α- 淀粉酶[A(1)](Megazyme 貨號：E-BSTAA)立即加到其中一支試管（樣品試管）中。在第二支試管（樣品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]。
5.渦旋[C(j)]試管 3 秒，輕輕蓋上管子（勿蓋緊），將它們立即轉(zhuǎn)移到微沸水浴中并啟動計時器。約 2min 后，擰緊蓋子并在渦旋混合器上劇烈混合試管內(nèi)容物 5秒（渦旋后放回微沸水浴中）。后再 5min 和 10min 后，分別再次渦旋混合試管。以加入 α-淀粉酶為起點開始計時，待孵育 15min 后，從微沸水浴中取出試管，再置于渦旋混合器上劇烈混合 5 秒，將試管置于 50°C 水浴鍋中，孵育 5 分鐘以上直至溫度穩(wěn)定。
6.使用 HandyStep®移液器，向其中一支試管（樣品試管）中加入 0.1mL 未稀釋的淀粉葡糖苷酶[A(2)]（AMG，Megazyme 貨號：E-AMGDF，3,300U/mL)，渦旋 3秒。在第二支試管（樣品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]。將各試管于 50°C 水浴中孵育 30min，勿再繼續(xù)混合。
7.從水浴中取出試管，讓它們冷卻至室溫超過 10min 后。將試管上下翻轉(zhuǎn)幾次，以確保試管蓋內(nèi)側(cè)的冷凝水與管中的液體混合。
8.分別取 2.0mL 溶液（樣品和樣品空白）轉(zhuǎn)移到微量離心管[B(a)]中，以 13,000rpm離心 5min（請保留試管中剩余的 8.2mL 孵育溶液并參考下面的注釋）。使用移液槍準(zhǔn)確吸取 1.0mL 上清液，轉(zhuǎn)移到 12x120mm 試管中，該試管已預(yù)先加入 4mL含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]，混合。
9.樣品一式兩份，準(zhǔn)確地吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃試管的底部。同時，樣品空白一式一份，吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃試管的底部。
同時進(jìn)行孵育的：
11.計算淀粉含量（參見第 F 部分，第 15 頁）。
1.研磨谷物、植物或其它食品樣品以通過 0.5 毫米的篩網(wǎng)。
1.通過使用渦旋混合器攪拌或上下翻轉(zhuǎn)來徹底混合樣品內(nèi)容物。如有必要，加熱或均質(zhì)樣品以獲得均勻的懸浮液。
1.通過在渦旋混合器上攪拌或上下翻轉(zhuǎn)來徹底混合樣品內(nèi)容物。如有必要，加熱或均質(zhì)樣品以獲得均勻的懸浮液。
1. 使用提供的瓶 1 中的內(nèi)容物。該溶液是粘性的，因此應(yīng)該用容積式分配器進(jìn)行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸頭 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S（用于移取 0.1 mL 的試樣）。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 4 年以上。
在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。
注：如果使用者參考 AOAC 官方方法 996.11（方法 c），請用含 5 mM 氯化鈣的MOPS 緩沖液（50 mM，pH 7.0）[B(e)]將瓶 1 的內(nèi)容物稀釋 30 倍后再使用。
2. 使用提供的瓶 2 中的內(nèi)容物。該溶液是粘性的，因此應(yīng)該用容積式分配器進(jìn)行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸頭 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S（用于移取 0.1 mL 的試樣）。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 4 年以上。
在-10°C 下可穩(wěn)定保存 10 年以上。
3. 將瓶 3（GOPOD 試劑緩沖液）用去離子水定容至 1L，配制完成后立即使用。
注：
（1）儲存時，濃縮緩沖液中可能會形成鹽晶體。當(dāng)該緩沖液用去離子水稀釋至 1L
（1）儲存時，濃縮緩沖液中可能會形成鹽晶體。當(dāng)該緩沖液用去離子水稀釋至 1L
時，它們必須完全溶解。
（2）該緩沖液含有 0.09% (w/v) 疊氮化鈉。這是一種有毒化學(xué)品，配制時請做好安全防
護(hù)。
4. 先將瓶 4 中的內(nèi)容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再將其和剩余的溶液 3 混勻。用鋁箔紙將試劑瓶包裹以避光放置。此試劑稱之為為葡萄糖測定試劑(GOPOD Reagent)。在 2-5°C 下可穩(wěn)定儲存約 3 個月。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 12 個月以上。
注：
（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲存，最好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用
（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲存，最好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用
過程中僅冷凍/解凍一次。
（2）新配制的試劑可能呈淡黃色或淡粉色。在 4°C 儲存的 2-3 個月內(nèi)，溶液顏色會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罘奂t色。以去離子水為背景時，該溶液的吸光度應(yīng)小于 0.05。
5＆6. 瓶 5、瓶 6 中的內(nèi)容物可直接使用。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
B. 試劑配制（本試劑盒不提供）
試劑 1 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液 (100mM，pH 5.0)將 5.8mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸餾水中。通過添加 1M (4g/100mL)氫氧化鈉溶液（需要大約 30mL）將 pH 值調(diào)節(jié)至 5.0。加入 0.74g 二水氯化鈣并溶解。定容至 1L，將該緩沖液儲存于 4°C，在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 6 個月以上。
試劑 2 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液 (200mM，pH 4.5)將 11.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸餾水中。通過添加 1M (4g/100mL)氫氧化鈉溶液（需要大約 60mL）將 pH 值調(diào)節(jié)至 4.5。加入 0.74g 二水氯化鈣并溶解。定容至 1L，將該緩沖液儲存于 4°C，在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 6 個月以上。
試劑 3 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液 (600mM，pH 3.8)將 69.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 1600mL 蒸餾水中。通過添加 4M（16g/100mL)氫氧化鈉溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 3.8。加入 1.48g 二水氯化鈣并溶解。定容至 2L。該緩沖液可在室溫下穩(wěn)定儲存 12 個月以上。
試劑 4 NaOH 溶液 (1.7M)將 68g NaOH 添加到 900mL 去離子水中并攪拌溶解，定容至 1L。儲存在密封容器中。在室溫下可穩(wěn)定儲存 2 年以上。
試劑 5 含氯化鈣（5mM）和疊氮化鈉（0.02%w/v）的 MOPS 緩沖液 (50mM，pH 7.0)
可選：僅當(dāng)使用程序 (c) 和 (d) 分析樣品時才需要。將 11.55g MOPS（鈉鹽，Sigma 目錄號 M9381）溶解在 900mL 蒸餾水中，通過添加 1M (10%v/v) HCl（需要約 17mL）將 pH 值調(diào)節(jié)至 7.0。加入 0.74 克二水氯化鈣和 0.2 克疊氮化鈉并溶解。定容至 1L。將該緩沖液儲存于 4°C，在 4°C 下可穩(wěn)定儲存 6 個月以上。
注意:待 pH 值調(diào)整完成后再加疊氮化鈉。疊氮化鈉酸化時會釋放出有毒氣體。
試劑 6 乙醇（50%和 80% v/v）50%v/v：將 500mL 乙醇(95%v/v)添加到 500mL 蒸餾水中。
80%v/v：將 800mL 乙醇(95%v/v)添加到 200mL 蒸餾水中。將各試劑儲存在 1L 試劑瓶中。在室溫下可穩(wěn)定儲存 4 年以上。
C. 需要的設(shè)備
1. 研磨機
2. 離心機（4000rpm）3. 微量離心管（13000rpm）
4. 分光光度計，能夠在 510 nm（10 mm 路徑長度）下運行
5. 分析天平
6. 恒溫水浴鍋（50℃）
7. 沸水浴鍋（配有試管架）
8. 磁力攪拌器
9. 渦旋攪拌器
10. 移液器/移液槍
11. 容積式移液器（如 Brand HandyStep® S）
12. 一次性離心管（13mL, 101×16.5mm）
13. 一次性微量離心管（2.0mL）
14. 玻璃試管（14mL, 16×100mm）
15. 康寧培養(yǎng)管（16 x 120 mm, 帶螺帽）
16. 塑料“午餐盒”（足夠容納試管架，作冰水浴用）
D. 控制和預(yù)防措施
a. 與 GOPOD 試劑進(jìn)行孵育的時間并不重要，但應(yīng)至少為 20 分鐘，并在顯色反應(yīng) 60 分鐘內(nèi)進(jìn)行吸光度檢測。
b. 每組檢測都應(yīng)包括空白試劑和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品對照（100 μg，一式四份）。葡萄糖-GOPOD 的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)具有線性。
i)空白試劑：0.1 mL 蒸餾水+ 3.0 mL GOPOD 試劑。
ii)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：0.1 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 (100 μg/0.1 mL) +3.0 mL GOPOD 試劑。系數(shù)因子“F”（第 15 和 16 頁）的計算方法是將分析的 D-葡萄糖質(zhì)量（100 μg）除以其在檢測中得到的吸光度結(jié)果（例如 100/1.038 = 96.386）。每次檢測所得到的吸光度值可能會有所不同。
c. 對于每一次檢測，都應(yīng)包括標(biāo)準(zhǔn)面粉或淀粉樣品。
d. 對于每新批次的 GOPOD 試劑，每 100 μg 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)達(dá)到終點時所需時間大約為 15 分鐘（通過顯色效果來判斷反應(yīng)是否到達(dá)終點）。
E. 操作流程(a)測定不含抗性淀粉的谷物和食品中的淀粉含量（推薦操作流程；在 pH5.0 下孵育），即總淀粉含量快速檢測(RTS)方法
1.碾磨谷物、植物或其它食品樣品以通過 0.5 毫米的篩網(wǎng)。
2.準(zhǔn)確稱取 100mg 測試樣品，一式兩份（一份作為樣品空白）放入帶蓋康寧培養(yǎng)(16x120mm)[C(q)]，記錄準(zhǔn)確的重量。輕敲試管，使樣品落到試管底部。
3.使用 Brand®瓶口分液器[C(m)]，分別向兩支試管中加入 10mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(100mM，pH5)[B(a)]，在渦旋混合器上劇烈攪拌試管 5 秒。
4. 使 用 HandyStep® 移液器 [C(l)] ， 將 0.1mL 未稀釋的耐熱 α- 淀粉酶[A(1)](Megazyme 貨號：E-BSTAA)立即加到其中一支試管（樣品試管）中。在第二支試管（樣品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]。
5.渦旋[C(j)]試管 3 秒，輕輕蓋上管子（勿蓋緊），將它們立即轉(zhuǎn)移到微沸水浴中并啟動計時器。約 2min 后，擰緊蓋子并在渦旋混合器上劇烈混合試管內(nèi)容物 5秒（渦旋后放回微沸水浴中）。后再 5min 和 10min 后，分別再次渦旋混合試管。以加入 α-淀粉酶為起點開始計時，待孵育 15min 后，從微沸水浴中取出試管，再置于渦旋混合器上劇烈混合 5 秒，將試管置于 50°C 水浴鍋中，孵育 5 分鐘以上直至溫度穩(wěn)定。
6.使用 HandyStep®移液器，向其中一支試管（樣品試管）中加入 0.1mL 未稀釋的淀粉葡糖苷酶[A(2)]（AMG，Megazyme 貨號：E-AMGDF，3,300U/mL)，渦旋 3秒。在第二支試管（樣品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]。將各試管于 50°C 水浴中孵育 30min，勿再繼續(xù)混合。
7.從水浴中取出試管，讓它們冷卻至室溫超過 10min 后。將試管上下翻轉(zhuǎn)幾次，以確保試管蓋內(nèi)側(cè)的冷凝水與管中的液體混合。
8.分別取 2.0mL 溶液（樣品和樣品空白）轉(zhuǎn)移到微量離心管[B(a)]中，以 13,000rpm離心 5min（請保留試管中剩余的 8.2mL 孵育溶液并參考下面的注釋）。使用移液槍準(zhǔn)確吸取 1.0mL 上清液，轉(zhuǎn)移到 12x120mm 試管中，該試管已預(yù)先加入 4mL含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]，混合。
9.樣品一式兩份，準(zhǔn)確地吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃試管的底部。同時，樣品空白一式一份，吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃試管的底部。
10.在各試管中加入 3.0mLGOPOD 試劑，混勻后。在 50°C 水浴中孵育 20min，冷卻后在 1h 內(nèi)于 510nm 處測量溶液吸光度（以樣品空白溶液為參照，僅當(dāng)進(jìn)行了樣品空白的測定時）。
同時進(jìn)行孵育的：
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)對照：0.1mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0mg/mL)加 3.0mLGOPOD 試劑，一式四份。
試劑空白對照：0.1mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]加 3.0mLGOPOD 試劑，一式兩份。（測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液時參照）
11.計算淀粉含量（參見第 F 部分，第 15 頁）。
注意:對于這個提取流程，最終的提取體積(EV)=10.2
注 1：如果樣品的 GOPOD 吸光度值小于 0.100，則無需進(jìn)一步稀釋即可直接分析樣品上清液（步驟 8）。如果吸光度值大于 1.20，則將 1.0mL 樣品上清液與10.0mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]充分混合，然后吸取 0.1mL 混合后的液體用于 GOPOD 分析。對于淀粉含量低于 1%(w/w)的樣品，將樣品量增加到 500mg，并直接分析 0.1mL 未稀釋的樣品溶液。
稀釋倍數(shù)(D)=1、5 或 11
注 2：當(dāng)檢測牧草、青貯飼料等高纖維樣品時，使用攪拌機研磨樣品（參見 KTSTA 視頻）。研磨時間約 60 秒（直到樣品均勻）。分析 500mg 樣品時，根據(jù)“a”流程進(jìn)行操作，但在微沸水浴中與耐熱 α-淀粉酶的孵育時間需延長至 60min。在淀粉葡糖苷酶孵育及冷卻至室溫等步驟后，對于淀粉含量大約在 20-30%的青貯樣品，用蒸餾水將1mL的樣品液稀釋20倍，充分混勻后吸取約2mL，以13,000rpm離心 5 分鐘，然后一式兩份，以 0.1mL 上清液與 GOPOD 試劑反應(yīng)。稀釋倍數(shù)(D)=20
b)測定含有抗性淀粉樣品的總淀粉含量（RTS-NaOH 流程-推薦）
1.準(zhǔn)確稱取 100mg 測試樣品，一式兩份，放入帶蓋康寧培養(yǎng)管(16x120mm)[C(q)]，記錄準(zhǔn)確的重量。輕敲試管，使樣品落到試管底部。
2.加入 0.2mL80%v/v 的乙醇水溶液，在渦旋混合器上混勻樣品（此步驟很重要，有助于高淀粉含量樣品的完全溶解）。
3.使用 HandyStep®移液器加入 2mL 的冷 1.7M 氫氧化鈉溶液[B(d)]，并在渦旋混合器上攪拌 15s。之后將試管放置于冰水浴中的試管架上，使用磁力攪拌器攪拌冰水浴 15min（第 18 頁，圖 2）。在此期間，還需要在渦旋混合器上間歇性地攪拌管中內(nèi)容物 2-3 次。確保樣品懸浮液沒有結(jié)塊。
3.使用 HandyStep®移液器加入 2mL 的冷 1.7M 氫氧化鈉溶液[B(d)]，并在渦旋混合器上攪拌 15s。之后將試管放置于冰水浴中的試管架上，使用磁力攪拌器攪拌冰水浴 15min（第 18 頁，圖 2）。在此期間，還需要在渦旋混合器上間歇性地攪拌管中內(nèi)容物 2-3 次。確保樣品懸浮液沒有結(jié)塊。
4.使用 Brand®瓶口分液器[C(m)]，加入 8mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(600mM，pH3.8)[B(c)]。在渦旋混合器上攪拌試管。調(diào)節(jié) pH 在 5.0 左右。
5.使用 HandyStep®移液器，將 0.1mL 未稀釋的耐熱 α-淀粉酶[A(1)]立即添加到其中一支試管（樣品管）中，然后將 0.1mL 淀粉葡糖苷酶（AMG，3,300U/mL)[A(2)]添加到同一管中。在第二支試管（樣品空白）中，加入 0.2mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液（100mM，pH5.0）[B(a)]。將兩個試管的蓋子蓋緊并渦旋 3 秒以上。
6.將試管在 50°C 水浴中孵育 30min。
7.從水浴中取出試管，冷卻至室溫。將試管上下倒轉(zhuǎn)幾次，以確保蓋子內(nèi)側(cè)的冷凝水與管中的液體充分混合。
8.按照第 9 頁上(a)方法中的步驟 8 繼續(xù)進(jìn)行操作。提取體積(EV)=10.4
稀釋倍數(shù)(D)=1、5 或 11
(c)測定不含抗性淀粉、D-葡萄糖及麥芽糊精的谷物和食品中的淀粉（AOAC 官
方方法 996.11）
1.研磨谷物、植物或其它食品樣品以通過 0.5 毫米的篩網(wǎng)。
2.將研磨樣品（約 100mg；準(zhǔn)確稱重）加入帶蓋康寧培養(yǎng)管（16x120mm）[C(q)]。輕敲試管以確保所有樣品都落到試管底部。
3.加入 0.2mL80%v/v 的乙醇水溶液，在渦旋混合器上混勻以分散樣品。
4.立即加入 3mL 稀釋后的耐熱 α-淀粉酶[A(1)]（α-淀粉酶用含 5mM 氯化鈣的MOPS 緩沖液（50mM，pH7.0）[B(e)]稀釋 30 倍），擰緊蓋子，將試管置于微沸水浴中孵育 6min，其中在第 2、4 和 6min 劇烈渦旋（以確保完全均勻）。
5.將試管置于 50°C 的水浴中，加入 4mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(200mM，pH4.5)[B(b)]，然后加入 0.1mL 淀粉葡糖苷酶（AMG，3,300U/mL)[A(2)]。使用渦旋混合器攪拌試管，在 50°C 水浴鍋中孵育 30min。6.將試管中的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到 100mL 容量瓶中（可使用漏斗輔助），并用洗瓶徹底沖洗試管中殘留的內(nèi)容物。使用含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(200mM，pH4.5)[B(b)]進(jìn)行定容并搖勻。
7.將每個樣品溶液取 2.0mL，轉(zhuǎn)移到微量離心管[C(o)]中，以 13,000rpm 的速度離心 5 分鐘。
8.每個樣品一式二份，準(zhǔn)確吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃試管的底部。
9.加入 3.0mLGOPOD 試劑并在 50°C 水浴中孵育 20min，于 510nm 處測量溶液吸光度（以試劑空白為參照）。
10.計算淀粉含量（參見第 F 部分，第 15 頁）。提取體積(EV)=100（參見第 15 頁的計算步驟）
稀釋倍數(shù)(D)=1(d)測定含有抗性淀粉但不含 D-葡萄糖和/或麥芽糊精的樣品的總淀粉含量
（DMSO 方法——AOAC 官方方法 996.11）
1.研磨谷物、植物或其它食品樣品以通過 0.5 毫米的篩網(wǎng)。
2.將研磨樣品（約 100mg；準(zhǔn)確稱重）加入帶蓋康寧培養(yǎng)管（16x120mm）[C(q)]。
3.加入 0.2mL80%v/v 的乙醇水溶液，在渦旋混合器上混勻以分散樣品。
4.立即向試管中加入 2mL 二甲基亞砜(DMSO)并在渦旋混合器上混勻。將試管置于劇烈沸騰的水浴中孵育，5 分鐘后取出。
5.立即將3mL耐熱α-淀粉酶[A(1)]（使用含5mM氯化鈣的MOPS緩沖液（50mM，pH7.0）稀釋 30 倍）[B(e)]加入至每個試管中，并在渦旋混合器上劇烈混合 20 秒。將試管放回至沸水浴中，孵育 6 分鐘，其中在第 2、4 和 6 分鐘時劇烈渦旋（以確保完全均勻）。
6.按照第 12 頁中的方法(c)步驟 5 繼續(xù)進(jìn)行實驗。
提取量（EV）=100；稀釋倍數(shù)(D)=1
(e)測定含 D-葡萄糖和/或麥芽糊精的樣品總淀粉含量的建議性程序（含/不含抗性淀粉）——用酒精洗滌去除 D-葡萄糖和麥芽糊精
[注意：麥芽糊精在乙醇水溶液中的溶解度主要取決于麥芽糊精的 DP 范圍、乙醇最終濃度和溶液溫度]。
1.研磨谷物、植物或其它食品樣品以通過 0.5 毫米的篩網(wǎng)。
2.將研磨樣品（約 100mg，準(zhǔn)確稱重）加入玻璃離心管（16x100mm；14mL 容量）[C(p)]。
3.加入 5.0mL 乙醇水溶液(80%v/v)并在 80-85°C 下孵育 5 分鐘。在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物，然后再加入 5mL 的 80%乙醇水溶液。
4.在臺式離心機[C(b)]上以 3250rcf(約 4,000rpm)離心 10 分鐘，丟棄上清液。
5.將沉淀重懸在 5mL 的 80%乙醇水溶液中，并在渦旋混合器上攪拌。再加入 5mL的 80%乙醇水溶液，并上下?lián)u勻混合。按步驟 4 離心并小心倒出上清液。
6.按照第 12 頁中的方法(c)步驟 4 繼續(xù)進(jìn)行實驗。
提取量（EV）=100；稀釋倍數(shù)(D)=1
或者：
如果樣品含有抗性淀粉，請從第 13 頁中程序(d)的步驟 4 繼續(xù)實驗。
提取量（EV）=100；稀釋倍數(shù)(D)=1
(f)測定樣品中以可溶或懸浮形式存在的淀粉含量
1.通過使用渦旋混合器攪拌或上下翻轉(zhuǎn)來徹底混合樣品內(nèi)容物。如有必要，加熱或均質(zhì)樣品以獲得均勻的懸浮液。
2.各個樣品一式兩份（一份作為樣品空白），使用移液器分別吸取 5mL（樣品和樣品空白），轉(zhuǎn)移到兩個康寧培養(yǎng)管（16x120mm）[C(q)]中。使用 Brand®瓶口分液器[C(m)]，向每個培養(yǎng)管中添加 5mL 含 5mM 氯化鈣的醋酸鈉緩沖液(200mM，pH4.5)[B(b)]。在渦旋混合器上劇烈攪拌培養(yǎng)管 5 秒。
3.對于樣品和樣品空白，按照第 9 頁步驟 4 中的程序(a)繼續(xù)操作。
4.計算淀粉含量（液體樣品計算，請參考第 16 頁的 F 部分）
稀釋樣品體積(DSV)=10.2mL
稀釋倍數(shù)(D)=1、5 或 11；樣品體積(SV)=5mL
(g)測定含有懸浮狀態(tài)抗性淀粉的樣品中的淀粉含量
1.通過在渦旋混合器上攪拌或上下翻轉(zhuǎn)來徹底混合樣品內(nèi)容物。如有必要，加熱或均質(zhì)樣品以獲得均勻的懸浮液。
2.各個樣品一式兩份（一份作為樣品空白），使用移液器分別吸取 2mL（樣品和樣品空白），轉(zhuǎn)移到兩個康寧培養(yǎng)管（16x120mm）[C(q)]中。使用 HandyStep®移液器加入 2mL 的冷 1.7M 氫氧化鈉溶液[B(d)]，并在渦旋混合器上攪拌 15s。之后將試管放置于冰水浴中的試管架上，使用磁力攪拌器攪拌冰水浴 15min（第 18頁，圖 2）。在此期間，還需要在渦旋混合器上間歇性地攪拌管中內(nèi)容物 2-3 次。確保樣品懸浮液沒有結(jié)塊。
3.對于樣品和樣品空白，按照第 11 頁步驟 4 中的程序(b)繼續(xù)操作。
稀釋樣品體積(DSV)=12.2mL
稀釋倍數(shù)(D)=1、5 或 11；樣品體積(SV)=2mL
(h)抗酶解淀粉的測定
使用Megazyme提供的抗性淀粉檢測試劑盒(K-RSTAR)或快速抗性淀粉檢測試劑盒(KRAPRS)準(zhǔn)確測量抗性淀粉。使用 K-RSTAR 或 K-RAPRS 獲得的結(jié)果與在體內(nèi)實驗中獲得的結(jié)果非常相似�？剐缘矸蹤z測試劑盒(K-RSTAR)已成功通過多個實驗室的評估（37 個實驗室，16 個樣品），并成為 AOAC 官方方法 2002.02 和AACC 方法 32-40.01。
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淀粉總量檢測
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