Megazyme方法β‑葡聚糖檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書
引言
一段時(shí)間以來(lái)，釀造、食品和配料行業(yè)已經(jīng)確定需要開發(fā)一種準(zhǔn)確、方便和可靠的方法來(lái)檢測(cè)大麥、麥芽、麥芽汁和啤酒中混合糖苷鍵的 β‑葡聚糖。Megazyme方法滿足所有這些要求。它使用簡(jiǎn)單，一天可以檢測(cè) 50‑100 個(gè)樣本。該方法還適用于燕麥和燕麥纖維產(chǎn)品中 β‑葡聚糖的檢測(cè)（改進(jìn)型方法，第 5 頁(yè)）。
反應(yīng)原理
將樣品置于 pH 6.5 的緩沖溶液中懸浮和水合，然后與純化的地衣聚糖酶一起孵育并過(guò)濾，之后用純化的 β‑葡糖苷酶將等分的濾液水解至完全，最后使用葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑測(cè)定產(chǎn)生的 D‑葡萄糖。
將樣品置于 pH 6.5 的緩沖溶液中懸浮和水合，然后與純化的地衣聚糖酶一起孵育并過(guò)濾，之后用純化的 β‑葡糖苷酶將等分的濾液水解至完全，最后使用葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑測(cè)定產(chǎn)生的 D‑葡萄糖。
準(zhǔn)確性
在我們的實(shí)驗(yàn)室中，燕麥和大麥樣品測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)誤差通常為± 3%。
評(píng)估
精簡(jiǎn)的 β‑葡聚糖方法已被 AOAC 國(guó)際（方法 995.16）、AACC（方法 32‑23.01）和 ICC（方法 166）成功評(píng)估。該方法的原始版本也成功地通過(guò)了澳大利亞皇家化學(xué)研究所分析委員會(huì)以及歐洲釀造公約的評(píng)估。
特異性
該測(cè)定對(duì)混合鍵 [(1‑3)(1‑4)]‑β‑D‑葡聚糖具有特異性。
試劑盒
Megazyme 提供可進(jìn)行 100 次檢測(cè)的試劑盒。該試劑盒包含完整的檢測(cè)方法以及：
瓶 1：地衣聚糖酶 [特異性，內(nèi)切‑(1‑3)(1‑4)‑β‑D‑葡聚糖 4‑葡聚糖水解酶] 懸浮液 (1 mL)。在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 3 年以上。
瓶 2：β‑葡萄糖苷酶 (1 mL) 懸浮液。在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 3 年以上。
瓶 3：GOPOD 試劑緩沖液。緩沖液（50 mL，pH 7.4），含對(duì)羥基苯甲酸和疊氮化鈉（0.09% w/v）。在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 4 年以上。
需要的設(shè)備
瓶 4：GOPOD 試劑酶。含葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶和 4-氨基安替比林。凍干粉。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 4 年以上。
瓶 5：D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶劑為 0.2% (w/v) 苯甲酸。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
瓶 6：標(biāo)準(zhǔn)化大麥粉質(zhì)控樣。小瓶標(biāo)簽上顯示的是 β‑葡聚糖含量。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
瓶 7：標(biāo)準(zhǔn)化燕麥粉質(zhì)控樣。小瓶標(biāo)簽上顯示的是 β‑葡聚糖含量。室溫保存，可穩(wěn)定保存 5 年以上。
試劑/懸液的制備：
1. 用 20 mM 磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）將瓶 1（地衣聚糖酶）的內(nèi)容物稀釋至 20.0mL，將其等分后儲(chǔ)存于聚丙烯管中，在低于‑10°C 可保存 2 年以上。使用期間需盡可能保持低溫。
注：該酶不得與 β‑葡萄糖苷酶發(fā)生交叉污染。
2. 用 50 mM 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）將瓶 2（β‑葡萄糖苷酶）的全部?jī)?nèi)容物稀釋至 20.0 mL，將其等分后儲(chǔ)存于聚丙烯管中，在低于‑10°C 可保存 2 年以上。
使用期間需盡可能保持低溫。
3. 將瓶 3（GOPOD 試劑緩沖液）用去離子水定容至 1L，配制完成后立即使用。
注：
（1）儲(chǔ)存時(shí)，濃縮緩沖液中可能會(huì)形成鹽晶體。當(dāng)該緩沖液用去離子水稀釋至 1L時(shí)，它們必須完全溶解。
（1）儲(chǔ)存時(shí)，濃縮緩沖液中可能會(huì)形成鹽晶體。當(dāng)該緩沖液用去離子水稀釋至 1L時(shí)，它們必須完全溶解。
（2）該緩沖液含有 0.09% (w/v) 疊氮化鈉。這是一種有毒化學(xué)品，配制時(shí)請(qǐng)做好安全防
護(hù)。
4. 先將瓶 4 中的內(nèi)容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再將其和剩余的溶液 3 混勻。
用鋁箔紙將試劑瓶包裹以避光放置。此試劑稱之為為葡萄糖測(cè)定試劑(GOPODReagent)。在 2-5°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存約 3 個(gè)月。在-10°C 下可穩(wěn)定保存 12 個(gè)月以上。
注：
（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲(chǔ)存，最好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用過(guò)程中僅冷凍/解凍一次。
（1）如果該試劑以冷凍狀態(tài)儲(chǔ)存，最好將其分裝為約 200 mL 的等分試樣，在使用過(guò)程中僅冷凍/解凍一次。
（2）新配制的試劑可能呈淡黃色或淡粉色。在 4°C 儲(chǔ)存的 2-3 個(gè)月內(nèi)，溶液顏色會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦畹姆奂t色，但不影響使用。
試劑配制（本試劑盒不提供）
試劑 1 磷酸鹽緩沖液 (20mM，pH 6.5)
將 3.12 g 二水磷酸二氫鈉(NaH2PO4.2H2O)溶解在 900 mL 蒸餾水中，通過(guò)加入100 mM 氫氧化鈉(4 g/L)(大概需要 50 mL)調(diào)節(jié) pH，并定容至 1L，最后加入疊氮化鈉 0.2 g。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 2 個(gè)月。
試劑 2 醋酸鈉緩沖液 (50mM，pH 4.0)
將 2.9mL 的冰醋酸添加到 900mL 蒸餾水中。通過(guò)添加 1M (40g/1L)氫氧化鈉溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 4.0，定容至 1L。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 2 個(gè)月。
試劑 3 醋酸鈉緩沖液 (200mM，pH 4.0)
將 11.6mL 的冰醋酸添加到 900mL 蒸餾水中。通過(guò)添加 1M (40g/1L)氫氧化鈉溶液將 pH 值調(diào)節(jié)至 4.0，定容至 1L。
在 4°C 下可穩(wěn)定儲(chǔ)存 2 個(gè)月。
需要的設(shè)備
1. 帶蓋的聚丙烯管/容器（35 mL 容量）
2. 玻璃試管（12 mL 容量）
3. 移液槍，例如 Gilson Pipetman® (100 μL 和 200 μL)
4. 容積式移液器，例如帶有 5.0mL 注射器吸嘴的 Eppendorf Multipette®
5. 可調(diào)節(jié)容量分配器：
⚫ 0‑5.0 mL（用于磷酸鹽緩沖液）
⚫ 3.0 mL（用于葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶試劑）
⚫ 0‑25.0 mL（蒸餾水）
6. 實(shí)驗(yàn)室烘箱
7. 分析天平
8. 分光光度計(jì)（可設(shè)置 510nm）
9. 渦旋混合器
控制和預(yù)防措施
操作流程
10. 恒溫水浴鍋（設(shè)置為 50°C，或根據(jù)第 10 頁(yè)原始版本中的方法設(shè)為 40°C）
11. 計(jì)時(shí)器
12. Whatman No.41 濾紙
13. 離心機(jī)(可用于麥芽，麥芽汁和啤酒的制備)。
14. 帶 0.5mm 篩網(wǎng)的實(shí)驗(yàn)室用研磨機(jī)（例如 Frisch pulverisette 14®）
15. 沸水浴裝置
控制和預(yù)防措施
1.每組測(cè)定均包含 100 µg 的空白試劑和 D‑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，一式兩份。空白試劑包含 0.1 mL 蒸餾水 + 0.1 mL 醋酸鈉緩沖液 + 3.0 mL GOPOD 試劑。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品包括 0.1 mL 醋酸鈉緩沖液 + 0.1 mL D‑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 (100 µg/0.1mL) + 3.0 mL GOPOD 試劑。
2. 每組至少測(cè)定一個(gè)大麥質(zhì)控樣。
3. 每批新的 GOPOD 試劑均應(yīng)檢查 100 µg D‑葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的最大顯色時(shí)間，這通常大約為 15 分鐘。
4. 地衣聚糖酶不能與 β‑葡萄糖苷酶制劑交叉污染。
操作流程
(a) 燕麥、大麥粉和纖維樣品的測(cè)定程序 ‑ 簡(jiǎn)化方法（AOAC 方法 995.16、AACC 方法 32‑23 和 ICC 標(biāo)準(zhǔn)方法 No. 166）
該程序適用于所有干燥樣品，尤其是那些含有高水平 β‑葡聚糖的樣品（例如加工過(guò)的燕麥麩產(chǎn)品）。
1. 使用 Fritsch pulverisette 14® (Fritsch GmbH Idar Oberstein, Germany)或類似的離心磨將大麥、燕麥或纖維樣品（約 50 克）磨碎以通過(guò) 0.5 毫米篩網(wǎng)。
2. 將面粉樣品（80‑120 mg；準(zhǔn)確稱重）加入玻璃試管（16 x 120 mm；17 mL 容量）中，輕敲試管以確保所有樣品都落到試管底部。
3. 用 0.2 mL 乙醇水溶液 (50% v/v) 潤(rùn)濕樣品，加入磷酸鈉緩沖液（4.0 mL，20mM，pH 6.5），渦旋混勻。
4. 混勻后，立即將試管放入沸水浴中孵育 60 秒。在渦旋混合器上劇烈攪拌混合物，在 100°C 下再孵育 2 分鐘并再次攪拌。
5. 將試管和內(nèi)容物在 50°C 水浴鍋中孵育 5 分鐘。
6. 加入地衣聚糖酶（0.2 mL，10 U）并攪拌試管內(nèi)容物。用封口膜封住試管，將其置于 50℃水浴鍋中孵育 1 小時(shí)，在旋渦攪拌器上進(jìn)行有規(guī)律的劇烈攪拌 3-4次。連續(xù)攪拌設(shè)備推薦：Megazyme Multi-stir IncubationBath (Cat. no. D-IBMKIII)。
7.加入醋酸鈉緩沖液（5.0 mL，200 mM，pH 4.0），在渦旋混合器上劇烈混合試管內(nèi)容物。
8.讓試管溫度平衡至室溫（約 5 分鐘）并離心（1,000 g 離心力，10 分鐘）。使用Gilson Pipetman®或 Rainin EDP‑2®將等分試樣 (0.1 mL) 小心準(zhǔn)確地分配到三個(gè)試管（容量為 12 mL）的底部。
9.將 溶解于 50 mM 醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0) 中的 β‑葡萄糖苷酶 (0.1 mL, 0.2 U)添加到其中兩個(gè)試管中（反應(yīng)組）。向第三個(gè)試管中（空白組）添加 50 mM 醋酸鈉緩沖液（0.1 mL，pH 4.0）。將所有試管在 50°C 下孵育 10 分鐘。
10.在各試管中加入 3.0mLGOPOD 試劑，混勻后在 50°C 水浴中孵育 20min。
11.從水浴中取出試管，冷卻后在 1h 內(nèi)于 510nm 處測(cè)量溶液吸光度（以空白溶液為參照）。
注意：試管中存在的 D‑葡萄糖量（即在被分析的 0.1 mL 樣品中）應(yīng)在 4 到 100μg之間。 β‑葡萄糖苷酶處理前的樣品溶液必須用 200 mM 醋酸鈉緩沖液 (pH 4.0)充分稀釋，以使糖濃度在 0.04 和 1.0 g/L 之間，約相當(dāng)于原始樣品中 0.35% 和8.5% 的 β‑葡聚糖。例如，如果樣品中含有 20%的 β‑葡聚糖，則應(yīng)先用 200 mM醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）將其稀釋 3 倍，然后再進(jìn)行分裝，與 β‑葡萄糖苷酶一起孵育。
或者，對(duì)于含有高 β‑葡聚糖的樣品，例如 Oatwell（β‑葡聚糖含量> 50%），樣品量應(yīng)減少至 50 mg，體積應(yīng)在地衣聚糖酶處理后用 200 mM 醋酸鈉緩沖液（pH4.0）調(diào)整至 100 mL。
（b) 煮熟、烘烤或擠壓谷物產(chǎn)品的測(cè)定程序 ‑ 簡(jiǎn)化方法（AOAC 方法 995.16、AACC 方法 32‑23 和 ICC 標(biāo)準(zhǔn)方法 166）
在分析煮熟、烘烤或擠壓谷物產(chǎn)品中的 β‑葡聚糖時(shí)，應(yīng)使用乙醇水溶液對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)提取，以去除游離糖并降低脂肪和油的含量。
1. 使用 Fritsch pulverisette 14® (Fritsch GmbH Idar Oberstein, Germany)或類似的離心磨將食品（約 50 克）磨碎以通過(guò) 0.5 毫米篩網(wǎng)。
2. 將樣品（約 200mg；準(zhǔn)確稱重）加入玻璃試管（16 x 120 mm；17 mL 容量）中，輕敲試管以確保所有樣品都落到試管底部。
3. 加入 5.0 mL 乙醇水溶液 (50% v/v)，將試管置于沸水浴中孵育 5 分鐘。在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物后，再加入 5.0 mL 50% (v/v) 乙醇水溶液，混合均勻。
4. 以 1,800 g（約 3,000 rpm）離心 10 分鐘，棄去上清液。
5. 將沉淀重懸于 5.0 mL 的 50% (v/v) 乙醇水溶液中，并在渦旋混合器上攪拌。再加入 5.0 m 的 50% 乙醇水溶液。在渦旋混合器上攪拌后，離心并棄去上清液（同步驟 4）。
6. 將沉淀懸浮在 4.0 mL 磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5）中，將試管在 50°C水浴鍋中孵育 5 分鐘。
7. 加入地衣聚糖酶（0.2 mL，10 U）并攪拌試管內(nèi)容物。用封口膜封住試管，將其置于 50℃水浴鍋中孵育 1 小時(shí)，在旋渦攪拌器上有規(guī)律的劇烈攪拌 3-4 次。
連續(xù)攪拌設(shè)備推薦：Megazyme Multi-stir IncubationBath (Cat. no. D-IBMKIII)。
8.加入醋酸鈉緩沖液（2.0 mL，200 mM，pH 4.0），在渦旋混合器上劇烈混合試管
內(nèi)容物。
9. 從方法（a）中步驟 8 開始，剩余步驟與其一致。
(c) 奶昔、酸奶和其他液體樣品（乙醇沉淀）的測(cè)定程序
1. 準(zhǔn)確稱量玻璃離心管（16 x 120 mm；17 mL 容量）。
2. 向試管中加入 3.0 mL 樣品，在沸水浴中加熱 5 分鐘。讓其冷卻至室溫。
3. 向試管中加入 3.0 mL 乙醇水溶液 (95% v/v)，在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物后，再加入 5.0 mL 95% (v/v) 乙醇水溶液，在渦旋攪拌器上混合均勻。
4. 以 1,800 g（約 3,000 rpm）離心 10 分鐘，棄去上清液。
計(jì)算（固體樣品）
5. 將沉淀重懸于 8.0 mL 的 50% (v/v) 乙醇水溶液中并在渦旋混合器上攪拌，離心并棄去上清液（同步驟 4）。
6. 將沉淀懸浮在 4.0 mL 磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5）中，將體積調(diào)整至 4.0mL（按重量計(jì)），將試管在 50°C 水浴鍋中孵育 5 分鐘。
7. 從方法（a）中步驟 6 開始，剩余步驟與其一致。
注意：如果樣品吸光度值超過(guò)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值，則必須用 200mM 醋酸鈉緩沖液（pH 4.0）稀釋樣品，以便在分配等分試樣與 β‑葡萄糖苷酶孵育之前使其處于合適的濃度范圍內(nèi)。
計(jì)算（固體樣品）
其中：
ΔA = β‑葡萄糖苷酶處理后的吸光度減去空白樣品溶液的吸光度
F = 將吸光度值轉(zhuǎn)換為葡萄糖 μg 量的轉(zhuǎn)換系數(shù)
=
100（D−葡萄糖的 μg 量）
100μgD−葡萄糖的吸光度
FV =最終體積（即，對(duì)于示例 (A) 中的燕麥和大麥粉為 9.4 mL；對(duì)于示例 (B)中煮熟、烘烤和擠壓的谷物產(chǎn)品，為 6.4 mL；對(duì)于含有 > 50% β‑葡聚糖的樣品，為 100mL，見第 6 頁(yè)注解）。
0.1 = 分析的樣品量。
1/1000 = 從 μg 轉(zhuǎn)換為 mg。
100/W = 以 β-葡聚糖含量占樣品重量的百分比為因子。
W = 所分析樣品的重量(以 mg 為單位)。
162/180 = 從確定的游離 D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫水-D-葡萄糖的因子，如在 β-葡聚糖中發(fā)生的一樣。
D = 在與 β‑葡萄糖苷酶孵育之前進(jìn)一步稀釋（如果需要）
計(jì)算（液體樣品；g/100 mL）
其中：
ΔA = β-葡萄糖苷酶處理后吸光度(反應(yīng))減去空白試劑的吸光度。
F = 將吸光度值轉(zhuǎn)換為葡萄糖 μg 量的轉(zhuǎn)換系數(shù)
=
100（D−葡萄糖的 μg 量）
100μg D−葡萄糖的吸光度
9.2/3.0 = 體積校正因子:3.0 mL 樣品用 IMS 處理，體積調(diào)整為 9.2 mL)(如 4.0 mL + 0.2 mL 地衣聚糖酶+ 5.0 mL 醋酸緩沖液)。
1000 = 體積調(diào)節(jié)因子(檢測(cè) 0.1 mL，但結(jié)果以每 100 mL 樣品表示)。
1/1000 = 從 μg 轉(zhuǎn)換為 mg。
1/1000 = 從 mg 轉(zhuǎn)換為 g。
162/180 = 從確定的游離 D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫水-D-葡萄糖的因子，如在 β-葡聚糖中發(fā)生的一樣。
D = 在與 β‑葡萄糖苷酶孵育之前進(jìn)一步稀釋（如果需要）。
注意：使用 Megazyme 的 Mega-CalcTM 可以簡(jiǎn)化這些計(jì)算，可在 Megazyme 網(wǎng)站上下載(www.megazyme.com)。
(d) 歐洲釀造公約批準(zhǔn)的大麥檢測(cè)程序（EBC 方法 3.10.1）
有用的提示：
1. 用地衣聚糖酶孵育樣品后，建議通過(guò)分配器加入 24.0 mL 蒸餾水，將反應(yīng)混合物* 的體積調(diào)整至 30.0 mL。
* 假設(shè)體積為 6.0 mL；大約在加熱步驟中損失了 0.2 mL。
2. 在測(cè)定程序的第 5 步中，如果溶液在沸騰 5 分鐘后變得非常粘稠，加入 5.0mL 蒸餾水并在渦旋混合器上充分?jǐn)嚢�。與地衣聚糖酶反應(yīng)后，加入 19.0 mL 蒸餾水，將體積調(diào)節(jié)至 30.0 mL。
注意：如果溶液非常粘稠，隨著地衣聚糖酶的擴(kuò)散，可能會(huì)出現(xiàn)一些問題。加入 5.0 mL蒸餾水可緩解這個(gè)問題。
3. 如果在步驟 5 中使用玻璃管而不是聚丙烯管，在測(cè)定過(guò)程中，首先將在沸水浴中的孵育時(shí)間減少到 45 秒，渦旋內(nèi)容物然后在沸水浴中再孵育 45 秒（即總共 1.5 分鐘）。
方法：
1. 使用 Tecator Cyclotec® 研磨機(jī)碾磨大麥以通過(guò) 0.5 mm 的篩網(wǎng)（均勻、精細(xì)的研磨是必不可少的）。
2. 將已知水分含量的大麥面粉樣品(約 0.5 克)準(zhǔn)確稱重，放入聚丙烯管中(參見設(shè)備，第 3 頁(yè)，第 1 點(diǎn))。
*參見第 11 頁(yè)“示例結(jié)果表”下的腳注。
3. 在每個(gè)試管中加入等分試樣 (1.0 mL) 的乙醇水溶液 (50% v/v)，以分散樣品。
4. 加入 5.0 mL 磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5），使用渦旋混合器攪拌試管。
5. 試管在沸水浴中孵育大約 2 分鐘(參見有用的提示的第 2 點(diǎn)和第 3 點(diǎn))。取出試管，在旋渦攪拌器上用力攪拌。在沸水浴中再加熱 3 分鐘(2 分鐘后混合防止形成凝膠塊)
6. 將試管冷卻至 40°C，并在每個(gè)試管中加入 0.2 mL 地衣聚糖酶 (10 U)。蓋上試管蓋，攪拌并在 40°C 下孵育 1 小時(shí)。
7. 通過(guò)添加蒸餾水將每管中的體積調(diào)整到 30.0 mL(參見有用的提示的第 1 點(diǎn))。
8. 徹底混合管中的內(nèi)容物，通過(guò) Whatman No. 41 濾紙過(guò)濾從每個(gè)試管中分離出來(lái)的混合物(或以大約 1000g 的離心力離心 10 分鐘)。
9. 小心準(zhǔn)確地從每個(gè)濾液中轉(zhuǎn)移等分試樣(0.1 mL)到三個(gè)試管的底部。
10. 在其中一個(gè)(空白組)中加入 0.1 mL 的醋酸鈉緩沖液(50 mM, pH 4.0)，在另兩個(gè)(反應(yīng)組)中加入 0.1 mL 用 50 mM 醋酸緩沖液(pH 4.0)稀釋的 β-葡萄糖苷酶(0.2U)。40°C 下孵育 15 分鐘。
11. 每管加入 3.0 mL GOPOD 試劑，在 40°C 下孵育 20 分鐘(見第 4 頁(yè)，控制和預(yù)防措施中的第 3 點(diǎn))。
12. 測(cè)量每個(gè)反應(yīng)組(EA)和空白組 (EBl)在 510 nm 處的吸光度。
注意:本試劑盒使用的 GOPOD 試劑，形成的顯色配合物在室溫下至少能穩(wěn)定 2小時(shí)。
結(jié)果示例表:
麥糟:
啤酒或麥芽汁（EBC 方法 8.13.1）：
干重=鮮重 x（100-水分含量%）* /100
*
一般來(lái)說(shuō)，這是由近紅外反射率決定的。另外，這也可以通過(guò)觀察面粉樣品(0.5 g)在 80℃下存放 20 小時(shí)的質(zhì)量下降情況來(lái)確定。谷物面粉樣品的水分含量始終保持在 10-14%的范圍內(nèi)(e) 歐洲釀酒公約認(rèn)可的麥芽、麥糟、啤酒和麥芽汁的檢測(cè)程序
麥芽（EBC 方法 4.16.1）：
1. 加入 1.0 g 麥芽粉(研磨至通過(guò) 0.5 mm 篩)或在麥芽制造過(guò)程中除去的凍干大麥樣品，加入 5.0 mL 乙醇(50% v/v)。
2. 在沸水浴中孵育 5 分鐘后，在渦旋攪拌器上混合內(nèi)容物，再加入 5.0 mL的 50% (v/v) 乙醇水溶液，混合。
3. 以 1,000 g 的離心力離心 10 分鐘，棄去上清液。
4. 將沉淀重懸于 10.0 mL 50% (v/v) 乙醇水溶液中，離心并棄去上清液（如上述步驟 3）。
5. 將顆粒懸浮在 5.0 mL 磷酸鈉緩沖液中(20 mM, pH 6.5)。
6. 從大麥測(cè)定流程中步驟 5 開始，剩余步驟與其一致。
麥糟:
用熱水(約 75°C)清洗麥糟，然后凍干，或不清洗凍干。將該材料磨碎至通過(guò) 0.5 mm 的篩，分析 β-葡聚糖含量，之后使用與麥芽樣品相同的程序進(jìn)行計(jì)算。
啤酒或麥芽汁（EBC 方法 8.13.1）：
1. 在沸水浴中加熱啤酒各等分試樣至約 80°C 來(lái)脫氣，之后讓其冷卻。
2. 在預(yù)先稱重的離心管(容量為 12 mL)中加入 5.0mL 麥芽汁或脫氣啤酒，再加入 2.5 克精細(xì)研磨的硫酸銨晶體。
3. 用 Parafilm®密封試管，小心的上下倒置以溶解硫酸銨(避免起泡)。
4. 讓試管靜置，然后在 4°C 下放置 20 小時(shí)。
5. 以 1,000 g 的離心力離心 10 分鐘。
6. 棄去上清液。
7. 用 1.0 mL 50% (v/v)乙醇水溶液重懸顆粒，并完全渦旋。再加入 10.0 mL的 50% (v/v)乙醇，通過(guò)試管來(lái)回倒置混合均勻。
8. 以 1,000 g 的離心力離心 5 分鐘，棄去上清液。
9. 重復(fù)上述步驟 7 和 8 中的乙醇洗滌程序，重新懸浮顆粒。
10. 棄去上清液。
注：對(duì)于含有低水平 β-葡聚糖的麥芽汁樣品，請(qǐng)用 β-葡萄糖苷酶孵育較大等份的樣品溶液（最多 0.5 mL）， 對(duì)空白組也應(yīng)使用這個(gè)更大的等份容量。同時(shí)，D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液也必須用蒸餾水進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，并相應(yīng)地修改計(jì)算。
計(jì)算:
11. 將顆粒重新懸浮在磷酸鈉緩沖液（20 mM，pH 6.5）中：對(duì)于麥芽汁，將
體積調(diào)整到 4.8 mL（按重量計(jì)）；對(duì)于啤酒，將體積調(diào)整到 1.8 mL（按重量計(jì)）。
12. 加入 0.2 mL 地衣聚糖酶 (10 U) 并在 40°C 下孵育 5 分鐘。以 1,000 g 的離心力離心 10 分鐘，從大麥測(cè)定流程中步驟 9 開始，剩余步驟與其一致。
注：對(duì)于含有低水平 β-葡聚糖的麥芽汁樣品，請(qǐng)用 β-葡萄糖苷酶孵育較大等份的樣品溶液（最多 0.5 mL）， 對(duì)空白組也應(yīng)使用這個(gè)更大的等份容量。同時(shí)，D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液也必須用蒸餾水進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，并相應(yīng)地修改計(jì)算。
計(jì)算:
對(duì)于大麥、麥芽和麥糟：
對(duì)于麥芽汁
對(duì)于啤酒：
不同方法的比較
其中：
ΔA = β-葡萄糖苷酶處理后的吸光度(反應(yīng))減去空白試劑的吸光度。
F = 將吸光度值轉(zhuǎn)換為葡萄糖 μg 量的轉(zhuǎn)換系數(shù)
=100（D−葡萄糖的 μg 量）/100μg D−葡萄糖的吸光度
300=容積校正（如從 30.0mL 中取 0.1mL）
10000=容積校正系數(shù)（分析了 0.1 mL，但結(jié)果顯示為每升樣品）
1/1000 = 從 μg 轉(zhuǎn)換為 mg。
100/W = 以 β-葡聚糖含量占干面粉重量的百分比為因子。
W = 所分析樣品的重量，以 mg 為單位（請(qǐng)參閱第 6 頁(yè)的示例結(jié)果表）。
5/5=體積校正因子。對(duì)于麥芽汁樣品，5.0 mL 的等分樣液用沉淀劑(硫酸銨)處理，體積調(diào)整為 5.0 mL(即 4.8 mL + 0.2 mL 地衣聚糖酶)。
2/5=體積校正因子。對(duì)于啤酒樣品，5.0mL 的等分樣液用沉淀劑(硫酸銨)處理,體積調(diào)整為 2.0 mL(即 1.8mL+ 0.2mL 地衣聚糖酶)。
162/180 = 從確定的游離 D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為脫水-D-葡萄糖的因子，如在 β-葡聚糖中發(fā)生的一樣。
注意:使用 Megazyme 的 Mega-CalcTM 可以簡(jiǎn)化這些計(jì)算，可在 Megazyme 網(wǎng)站上下載(www.megazyme.com)。
不同方法的比較
在實(shí)驗(yàn)室間的評(píng)估中，已將 Megazyme 改進(jìn)型 β-葡聚糖方法與 AACC 方法32-22（原始 Megazyme 方法的 AACC 修改）1 進(jìn)行了比較，兩種方法獲得的結(jié)果非常相似。 Megazyme“改進(jìn)型方法”的結(jié)果如表 1 所示。
使用這種方法，一個(gè)分析人員一天可以分析 100 多個(gè)樣品。與之相比，使用AACC 方法 32-22 ，只能分析大約 20 個(gè)樣品。
表 1：采用改進(jìn)型酶法測(cè)定燕麥中 β-D-葡聚糖的方法性能. a
a
基于 8 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果； 未發(fā)現(xiàn)異常值
b
r = 2.8 x sr
c
R = 2.8 x sR
酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化：
使用對(duì)硝基苯基 β-葡萄糖苷作為底物對(duì) β-葡萄糖苷酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。一個(gè)單位定義為在 pH 4.0 和 40°C 條件下每分鐘從對(duì)硝基苯基 β-葡萄糖苷 (10 mM) 中釋放 1 微摩爾對(duì)硝基苯酚所需的酶量。使用 Nelson/Somogyi 還原糖程序，在 40°C的磷酸鈉緩沖液 (pH 6.5) 中測(cè)定大麥 β-葡聚糖 (10 mg/mL) 的地衣聚糖酶活性。一單位活性定義為在規(guī)定的測(cè)定條件下，每分鐘釋放 1 微摩爾 D-葡萄糖還原糖當(dāng)量所需的酶量。
標(biāo)簽：
β‑葡聚糖[混聯(lián)]檢測(cè)
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