肝細(xì)胞癌（HCC）作為最常見的原發(fā)性肝癌，在中國發(fā)病率位居第三，死亡率在近十年內(nèi)更是飆升了50%。它不僅嚴(yán)重威脅患者的生命健康，也給醫(yī)療研究帶來諸多難題。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢測方法，如核磁共振成像（MRI）、計算機斷層掃描（CT）和超聲成像等，都存在一定的局限性，難以精確地對HCC的微血管結(jié)構(gòu)和微環(huán)境功能進(jìn)行成像。而近年來，光聲成像技術(shù)嶄露頭角，為肝癌研究帶來了新的希望。今天，就讓我們一起深入了解這項神奇的技術(shù)，以及它在肝癌微血管研究中的重要作用。

研究背景
肝癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀與傳統(tǒng)檢測難題
正常情況下，肝臟細(xì)胞有序生長和代謝，但當(dāng)肝細(xì)胞癌發(fā)生時，肝細(xì)胞會不受控制地分裂，在肝臟內(nèi)部形成腫瘤。目前臨床常用的肝癌檢測手段中，MRI雖然能識別腫瘤位置，評估多種肝功能參數(shù)，但分辨率較低，無法對微小血管成像，且使用外源造影劑存在安全隱患；CT可以對腫瘤微小病灶成像，卻因使用電離輻射而增加了潛在的癌癥風(fēng)險；超聲成像作為一種非入侵的成像技術(shù)，其準(zhǔn)確性很大程度上依賴于操作者的經(jīng)驗。所以，迫切需要一種更先進(jìn)的技術(shù)來突破這些困境。

在實際操作中，研究人員選擇不同的激光激發(fā)肝臟血液的聲波信號。這是因為血紅蛋白分子與氧氣結(jié)合形成的含氧血紅蛋白與不含氧的脫氧血紅蛋白在這兩個波長下的摩爾消光系數(shù)不同。利用這一特性，通過量化含氧血紅蛋白濃度和脫氧血紅蛋白濃度，就可以計算出血氧飽和度，從而評估腫瘤新生血管的氧水平。血氧飽和度是表征腫瘤微環(huán)境的重要指標(biāo)，因為氧氣對于生命活動至關(guān)重要，缺氧環(huán)境會導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常、免疫調(diào)節(jié)失衡，甚至心肺功能下降，通過監(jiān)測血氧飽和度，有助于深入了解腫瘤的生長狀態(tài)和微環(huán)境變化。

多項研究已證實光聲成像在肝癌診斷方面取得了顯著成果。Yin等人利用光聲染料實現(xiàn)了HCC細(xì)胞特異性光聲成像；Zhou等人借助表皮生長因子受體（EGFR）的靶向作用，成功提高了光聲技術(shù)對HCC的特異性檢測效率；Qi等人則利用光聲成像進(jìn)行實時測量，準(zhǔn)確實現(xiàn)了腹腔內(nèi)HCC的診斷和治療。

基于光聲顯微成像的肝癌微血管研究實驗
實驗儀器與準(zhǔn)備
研究使用的高分辨率光聲顯微鏡（PAM）成像系統(tǒng)十分精密。由兩臺波長獨立激光器提供光源，兩束脈沖激光經(jīng)過分束器耦合，再通過聚焦透鏡、針孔、鍍鋁反射鏡等一系列光學(xué)元件，最終被物鏡聚焦在樣品上激發(fā)超聲信號。超聲換能器負(fù)責(zé)采集反射回的光聲信號，而后利用放大器和數(shù)據(jù)采集卡將信號傳輸?shù)接嬎銠C上進(jìn)行重建，整個過程中的數(shù)據(jù)采樣率、掃描步距和激光觸發(fā)均由計算機精準(zhǔn)控制。在實驗前，科研人員先對肝癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中，在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時進(jìn)行消化，利用離心機收集細(xì)胞，最后用細(xì)胞懸液，并與基質(zhì)膠混合備用。

小鼠肝細(xì)胞癌原位模型構(gòu)建
實驗選用雄性裸鼠，飼養(yǎng)在26℃無特定病原體的環(huán)境中。構(gòu)建模型時，先對小鼠進(jìn)行消毒處理并麻醉，接著用無菌手術(shù)器械在小鼠腹部切開約5mm的傷口，暴露肝葉。然后用接種針吸取20μL細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合物，注射到小鼠肝臟淺表，縫合傷口后注射抗生素觀察3天。在注射7天后，使用小動物活體熒光成像系統(tǒng)對小鼠肝臟進(jìn)行成像，以此確定腫瘤位置。

腫瘤定位與成像分析
在進(jìn)行活體成像之前，將小鼠暴露在暗室中12h，再通過腹腔注射熒光素溶液。熒光素底物在小鼠體內(nèi)發(fā)生代謝反應(yīng)5min后，使用小動物活體熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。通過觀察熒光素在小鼠體內(nèi)的分布情況，就能準(zhǔn)確確定腫瘤位置。之后，將活體成像數(shù)據(jù)導(dǎo)入圖像分析軟件進(jìn)行處理和分析。利用高分辨率光聲顯微鏡對小鼠的HCC組織和正常組織進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能成像。采集到的原始數(shù)據(jù)會導(dǎo)入到軟件中，通過反投影濾波重建和光譜分離算法，提取血管密度等參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

實驗結(jié)果：肝癌微血管的獨特特征
小動物活體成像驗證模型成功構(gòu)建
利用小動物活體成像系統(tǒng)，通過調(diào)整對應(yīng)的濾光片，選擇生物發(fā)光模式進(jìn)行成像。在成像過程中，調(diào)整熒光圖像信號值范圍，能夠清晰地將熒光強度最大的區(qū)域定位為腫瘤的位置。這一實驗結(jié)果有力地證明了HCC模型已成功構(gòu)建，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

而HCC模型鼠的肝表面PAM圖像則呈現(xiàn)出截然不同的景象。腫瘤邊界的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，血管扭曲；腫瘤旁邊的血管網(wǎng)絡(luò)比正常肝臟更復(fù)雜，肝靜脈形態(tài)異常，直徑變粗且排列不規(guī)則，出現(xiàn)多個分支和畸形小血管；腫瘤內(nèi)部血管呈蛛網(wǎng)狀向腫瘤中心生長。對腫瘤組織周圍及腫瘤中心的微血管直徑進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，正常小鼠右下肝葉位置的肝小葉血管直徑為15-20μm，而HCC鼠的癌旁小葉間肝靜脈分支直徑約為25μm，癌旁肝靜脈異常分支直徑分別為38μm和30μm，腫瘤中心血管直徑約為75μm，與正常血管相比，腫瘤血管直徑顯著增加。

腫瘤微血管密度與直徑特征改變
對光聲圖像進(jìn)行二值化處理后發(fā)現(xiàn)，與正常血管相比，癌變組織的血管密度整體減小。利用聚類算法對血管進(jìn)行分類，并沿同一水平線提取信號值統(tǒng)計血管直徑，結(jié)果顯示癌旁血管出現(xiàn)異常增生，血管直徑顯著增加，主要集中在0-40μm，而正常肝臟組織的血管直徑主要分布在0-20μm范圍內(nèi)。

肝癌微血管氧代謝功能異常
通過雙波長圖像的像素值計算肝臟血管的血氧飽和度，結(jié)果顯示正常肝臟的血管結(jié)構(gòu)清晰，氧氣供應(yīng)充足，中央靜脈的血氧值比肝動脈略低。但在腫瘤組織中，微血管的異常結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了血流的不均勻分布。癌旁肝小葉明顯低于正常肝小葉，腫瘤附近肝靜脈血液供應(yīng)不足造成周圍組織缺氧，血管氧代謝能力降低。腫瘤中心的血管結(jié)構(gòu)不完整，新生細(xì)微分支較多，需要更多的氧氣供應(yīng)，比周圍組織更低。

應(yīng)用總結(jié)與前景
在腫瘤微血管監(jiān)測方面，它能夠提供高分辨率的圖像，更準(zhǔn)確地檢測微小血管和異常血管的形態(tài)，大大提高早期癌癥檢測的準(zhǔn)確率。通過對圖像進(jìn)行分析，還可以評估微血管的密度、直徑等指標(biāo)，獲得腫瘤組織的氧合水平和代謝活性等信息，從而判斷腫瘤的生長狀態(tài)并預(yù)測腫瘤的惡性程度。目前，一些抗血管生成藥物已經(jīng)應(yīng)用于HCC的治療，這些藥物通過抑制腫瘤微血管的生長、破壞已有的血管、阻斷血管通路等方式，減少腫瘤組織的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移通路，達(dá)到抑制HCC生長和轉(zhuǎn)移的目的。光聲成像技術(shù)能夠清晰地觀察腫瘤微血管的變化，為評估這些抗血管生成藥物的療效提供了有力的工具。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
孫彤, 黃國家, 張振輝. 基于高分辨光聲顯微成像的肝癌微血管特征分析[J]. 中國激光, 2023, 50(15): 1507105.
DOI：10.3788/CJL230615