乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重威脅著女性的健康。近年來，隨著醫(yī)學(xué)成像技術(shù)的不斷進(jìn)步，多光子顯微技術(shù)（MPM）作為一種先進(jìn)的醫(yī)學(xué)成像手段，逐漸在乳腺癌的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中展現(xiàn)出巨大的潛力。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
乳腺癌的全球現(xiàn)狀
乳腺癌長(zhǎng)期以來占據(jù)全球女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）最新發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，乳腺癌的發(fā)病數(shù)已經(jīng)超過肺癌，成為全球第一大癌癥。乳腺癌的高度異質(zhì)性使得患者的個(gè)體差異顯著，因此，如何準(zhǔn)確預(yù)測(cè)乳腺癌的生物學(xué)行為，成為臨床治療中的一大挑戰(zhàn)。

技術(shù)挑戰(zhàn)
盡管多光子顯微技術(shù)在成像分辨率、無標(biāo)記、免切片、光學(xué)層析成像等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，但其在乳腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)中的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，乳腺癌的微環(huán)境復(fù)雜，包含多種細(xì)胞和基質(zhì)成分，如何準(zhǔn)確識(shí)別和量化這些成分的變化是一個(gè)難題。其次，現(xiàn)有的預(yù)后預(yù)測(cè)模型主要依賴于腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和分子表達(dá)信息，忽略了腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的重要作用。因此，開發(fā)一種能夠綜合考慮腫瘤微環(huán)境特征的預(yù)后預(yù)測(cè)系統(tǒng)，成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
多光子顯微技術(shù)的原理創(chuàng)新
多光子顯微技術(shù)的核心創(chuàng)新是基于的非線性光學(xué)效應(yīng)，即雙光子激發(fā)熒光（TPEF）和二次諧波（SHG）。雙光子激發(fā)熒光是一個(gè)三階非線性吸收過程。在這個(gè)過程中，一個(gè)熒光分子或者原子同時(shí)吸收兩個(gè)相同頻率的光子，獨(dú)特的激發(fā)方式使得雙光子激發(fā)熒光具有更高的空間分辨率和更深的成像深度，能夠在不破壞組織的情況下對(duì)深層組織進(jìn)行成像。

二次諧波是一種二階非線性光學(xué)現(xiàn)象，也稱為 “倍頻”。當(dāng)具有相同頻率的兩個(gè)光子與非線性介質(zhì)相互作用時(shí)，其輸出光子頻率為入射光子頻率的二倍，這個(gè)輸出的二倍頻光波就是二次諧波。二次諧波的產(chǎn)生與介質(zhì)的二階極化率密切相關(guān)，而二階極化率又與介質(zhì)本身的特性，如電子態(tài)、分子對(duì)稱性、旋向及排列等有關(guān)。因此，二次諧波可以作為一種靈敏的組織材料特性指標(biāo)，反映介質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)特性。
在乳腺腫瘤研究中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

多光子顯微技術(shù)在乳腺腫瘤微環(huán)境研究中無需外源性染色劑，就能對(duì)各種組分進(jìn)行成像，避免了染色劑對(duì)組織的干擾和損傷。該技術(shù)具有光學(xué)層析成像能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織的三維成像，全面觀察腫瘤微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和組成。多光子顯微技術(shù)能夠反映細(xì)胞的功能代謝信息，通過分析細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度和光譜特征，可以了解細(xì)胞的代謝狀態(tài)和功能活性。此外，還具有三維靶向消融能力、較低的光漂白與光損傷以及高成像對(duì)比度等優(yōu)勢(shì)，為乳腺癌的研究和診斷提供了有力的工具。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
膠原纖維成像結(jié)果及分析
形態(tài)特征分析：通過對(duì)膠原纖維的SHG成像，直接從多光子顯微圖像上分析其形態(tài)特征。Han等利用膠原纖維SHG光的偏振性和方向性，確定了小鼠乳腺腫瘤模型中膠原蛋白與健康乳腺脂肪墊間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生SHG的膠原亞群不受腫瘤間質(zhì)膠原合成改變的影響，且受到異常降解環(huán)境的保護(hù)。通過對(duì)正向和反向傳播SHG信號(hào)的比值進(jìn)行定量分析，能夠監(jiān)測(cè)整個(gè)導(dǎo)管和小葉癌發(fā)展過程中的膠原纖維變化。Natal等對(duì)不同類型浸潤(rùn)性乳腺癌患者的組織切片進(jìn)行SHG成像并評(píng)價(jià)膠原參數(shù)，結(jié)果表明通過膠原參數(shù)可以識(shí)別出三種主要的乳腺癌組。研究小組將這種膠原纖維重塑特征定義為腫瘤相關(guān)膠原纖維特征（TACS1-3）。

計(jì)算機(jī)輔助圖像分析：Falzon等利用SHG成像對(duì)正常和病變?nèi)橄俳M織中的膠原纖維形態(tài)改變進(jìn)行定性分析，并采用橢圓傅里葉分析量化相關(guān)指標(biāo)來區(qū)分乳腺腫瘤的性質(zhì)。Bredfeldt等利用大視場(chǎng)高分辨率顯微鏡技術(shù)、圖像處理和監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，半自動(dòng)化地量化膠原纖維排列特征，實(shí)現(xiàn)了TACS候選生物標(biāo)志物的半自動(dòng)采集和分析，其量化得分可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)乳腺癌患者的生存期。Majeed等利用新的無標(biāo)記定量相位成像技術(shù)，更快速地提取膠原纖維定向排列信息以反映乳腺疾病的不同分期。

Natal等通過SHG成像量化管腔型乳腺腫瘤患者瘤周與瘤內(nèi)膠原纖維特征差異，發(fā)現(xiàn)較高的瘤內(nèi)膠原纖維一致性與較高的病理分期和腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Gole等采用基于雙模式高斯混合模型（GMM）的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析方法，細(xì)化膠原纖維特征，比較不同定量參數(shù)對(duì)三陰性乳腺癌預(yù)后的價(jià)值。Sprague等基于curvelet變化算法更全面地提取乳腺導(dǎo)管原位癌病變周圍膠原纖維的形態(tài)特征，這些特征與乳腺導(dǎo)管原位癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Xi等采用基于高斯混合模型的分割算法和纖維網(wǎng)絡(luò)提取算法等，建立的TCMF-score具有較強(qiáng)的預(yù)后性能，對(duì)所有乳腺癌患者都有很好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。

腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞成像結(jié)果及分析
腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，與乳腺癌患者預(yù)后密切相關(guān)，可分為間質(zhì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（sTILs）和上皮內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（iTILs）。不同研究表明，高密度TILs浸潤(rùn)對(duì)不同分子亞型的乳腺癌預(yù)后影響不同，對(duì)ER陰性的三陰性乳腺癌及HER2過表達(dá)型乳腺癌有較好預(yù)后，而對(duì)ER陽性的管腔型患者預(yù)后效果尚無定論。

He等直接從無標(biāo)記病理樣品的多光子顯微病理圖像出發(fā)，根據(jù)TILs與腫瘤細(xì)胞、膠原纖維的相對(duì)位置將TILs重新分為3種�；�于這三種模式的出現(xiàn)頻率，結(jié)合嶺回歸分析提出了一種評(píng)估TILs預(yù)后價(jià)值的新方法，即腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞評(píng)分（TILs-score）。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，TILs-score對(duì)ER陽性乳腺癌患者具有更強(qiáng)的預(yù)后價(jià)值。

深遠(yuǎn)意義與未來展望
在臨床方面，分析腫瘤微環(huán)境中膠原纖維、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞等組分，能精準(zhǔn)預(yù)測(cè)患者預(yù)后，助力醫(yī)生制定個(gè)性化方案，避免治療不當(dāng)，提升患者生存率與生活質(zhì)量，比如對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者采取差異化治療。在科研上，為乳腺癌基礎(chǔ)研究提供新途徑，有助于探究腫瘤微環(huán)境作用機(jī)制及細(xì)胞與組織關(guān)系，為開發(fā)新療法提供理論依據(jù)。在未來，基于腫瘤微環(huán)境的乳腺癌預(yù)測(cè)模型是發(fā)展趨勢(shì)。一方面要優(yōu)化多光子顯微成像技術(shù)，如研發(fā)先進(jìn)設(shè)備、結(jié)合新型成像技術(shù)獲取更多信息；另一方面要加強(qiáng)計(jì)算機(jī)輔助圖像分析研究，利用人工智能等構(gòu)建更精準(zhǔn)的預(yù)后評(píng)估模型。此外，還需開展多中心大樣本臨床研究，推動(dòng)該技術(shù)廣泛應(yīng)用，為乳腺癌患者帶來希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
徐順武, 何佳佳, 席剛琴, 李連煌, 韓俠輝, 鄭莉琴, 陳建新. 多光子顯微技術(shù)在乳腺腫瘤微環(huán)境預(yù)后預(yù)測(cè)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2022, 59(6): 0617013. 

DOI:10. 3788/LOP202259. 0617013.