神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等，目前仍缺乏有效的治療手段。想要攻克這些難題，深入了解大腦在疾病狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和功能變化至關(guān)重要，而這離不開強(qiáng)大的成像技術(shù)支持。今天，就讓我們一同走進(jìn)大腦成像的前沿領(lǐng)域，探索組織透明化和膨脹顯微成像技術(shù)的神奇之處。
 

研究背景
大腦成像：神經(jīng)退行性疾病研究的關(guān)鍵鑰匙
神經(jīng)退行性疾病種類繁多，包括阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷頓病（HD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）等。大腦的結(jié)構(gòu)和功能極其復(fù)雜，不同細(xì)胞群體之間的連接和活動(dòng)模式?jīng)Q定了其功能。在神經(jīng)退行性疾病中，特定細(xì)胞類型的結(jié)構(gòu)變化往往是疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。要深入理解神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，就需要對(duì)大腦進(jìn)行全面、細(xì)致的成像分析，從細(xì)胞和分子層面揭示其病理變化。然而，標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡受光衍射極限的限制，而電子顯微鏡雖然能實(shí)現(xiàn)高分辨率的超微結(jié)構(gòu)分析，但缺乏多色熒光顯微鏡的分子特異性和通量，難以同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行成像。

突破成像障礙：組織透明化的誕生
該技術(shù)通過使組織的折射率均勻化，讓樣本變得透明，從而可以使用熒光顯微鏡從一端到另一端對(duì)樣本進(jìn)行成像。其中，光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種非常有效的成像工具，它能產(chǎn)生薄激光片來照亮整個(gè)樣本中的單個(gè)平面，實(shí)現(xiàn)對(duì)大型標(biāo)本（如整個(gè)小鼠大腦甚至完整的人體器官）的高速、高分辨率成像。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
超越衍射極限：膨脹顯微成像的原理與優(yōu)勢(shì)
為了突破光學(xué)顯微鏡的衍射極限，實(shí)現(xiàn)對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的高分辨率成像，科研人員開發(fā)了多種光學(xué)超分辨率顯微鏡（SRM）方法，如受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡、光活化定位顯微鏡（PALM）、結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM）等。這些方法雖然能夠分辨30-100nm，但存在設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、多色成像困難等問題，限制了其在大多數(shù)生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用。

膨脹顯微成像（ExM）通過使用可膨脹的水凝膠在整個(gè)組織中交聯(lián)，誘導(dǎo)樣本各向同性膨脹，從而使樣本中的結(jié)構(gòu)在常規(guī)光學(xué)顯微鏡下也能實(shí)現(xiàn)超分辨率成像。目前的組織膨脹方法可以使組織實(shí)現(xiàn)高達(dá)約4.5倍、10倍甚至約20倍的各向同性膨脹，使用常規(guī)共聚焦顯微鏡就能實(shí)現(xiàn)高達(dá)約25nm分辨率的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)成像。膨脹顯微成像操作相對(duì)簡(jiǎn)單，并且與多色免疫染色和熒光原位雜交（FISH）兼容，能夠?yàn)樯窠?jīng)病理學(xué)研究提供豐富的分子和結(jié)構(gòu)信息。

膨脹顯微成像下的神經(jīng)退行性疾�。盒碌陌l(fā)現(xiàn)與見解
膨脹顯微成像在神經(jīng)退行性疾病研究中發(fā)揮了重要作用，為我們揭示了許多以往難以觀察到的微觀變化。在研究亨廷頓病時(shí)，不同的光學(xué)SRM方法，如STORM和STED SRM，被用于研究亨廷頓蛋白聚集狀態(tài)，包括在活細(xì)胞、固定細(xì)胞中和其他纖維狀物質(zhì)的形成；SIM SRM則用于研究突變的亨廷頓蛋白（mHTT）聚集體與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，這可能導(dǎo)致了基因表達(dá)的改變。

在阿爾茨海默病研究中，不同的光學(xué)SRM方法幫助研究人員在體外和細(xì)胞模型，STED SRM還用于對(duì)死后大腦切片中的免疫標(biāo)記進(jìn)行成像。此外，還利用拓增顯微鏡發(fā)現(xiàn)了一些與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的新結(jié)構(gòu)和分子機(jī)制。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
透明化助力疾病研究：在神經(jīng)病理學(xué)中的應(yīng)用實(shí)例
組織透明化技術(shù)為神經(jīng)病理學(xué)研究帶來了新的契機(jī)，讓科研人員能夠在更大的空間尺度上評(píng)估神經(jīng)病理特征。在阿爾茨海默病研究中，研究人員利用組織透明化方法取得了許多重要發(fā)現(xiàn)。例如，Huang及其同事使用熒光染料對(duì)斑塊進(jìn)行染色，結(jié)合使用熒光團(tuán)標(biāo)記的凝集素對(duì)血管進(jìn)行標(biāo)記，并對(duì)整個(gè)小鼠大腦進(jìn)行透明化處理。Hama等人應(yīng)用組織透明化方法，在小鼠和人類大腦的整個(gè)半腦以及1-2mm厚的切片中可視化斑塊、小膠質(zhì)細(xì)胞和大腦超微結(jié)構(gòu)，通過對(duì)斑塊、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的染色，發(fā)現(xiàn)能較好地保留大腦超微結(jié)構(gòu)，有助于使用顯微鏡檢測(cè)突觸后密度。此外，基于水凝膠的方法也被用于可視化人類大腦樣本中，以及在小鼠模型中觀察黑質(zhì)紋狀體軸突的碎片化和人類大腦中的路易小體病理。

聯(lián)合應(yīng)用的潛在價(jià)值
在神經(jīng)病理學(xué)研究中，組織透明化方法可以與細(xì)胞類型特異性標(biāo)記、突觸標(biāo)記以及神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮性指標(biāo)或神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性指標(biāo)的分析相結(jié)合，識(shí)別出受病理影響的相關(guān)大腦回路，研究不同神經(jīng)病理如何影響全腦特定細(xì)胞群體的活動(dòng)，從而深入了解神經(jīng)退行性疾病中不同回路和神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)亞型選擇性-差異性易損性的細(xì)胞機(jī)制。同時(shí)，結(jié)合自動(dòng)成像和數(shù)據(jù)分析，可以評(píng)估潛在的治療策略。而膨脹顯微鏡則可以進(jìn)一步深入研究細(xì)胞類型特異性的分子機(jī)制，mRN和蛋白質(zhì)定位的改變、局部突觸翻譯、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和病理蛋白質(zhì)聚集等。

深遠(yuǎn)意義與展望未來
隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，組織透明化和膨脹顯微成像技術(shù)在未來還有很大的提升空間。在組織化學(xué)和光學(xué)方面的進(jìn)步，以及開源光片顯微鏡的發(fā)展，將提高這些技術(shù)的適用性，增加可成像的生物分子范圍和分辨率。同時(shí)，計(jì)算技術(shù)的發(fā)展，包括優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析工具、標(biāo)準(zhǔn)化的流程、數(shù)據(jù)格式和數(shù)據(jù)共享平臺(tái)，將有助于對(duì)大量的腦成像數(shù)據(jù)進(jìn)行定量評(píng)估和系統(tǒng)生物學(xué)層面的解釋，推動(dòng)神經(jīng)退行性疾病研究取得更多突破。雖然目前這些技術(shù)還面臨一些挑戰(zhàn)，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們能夠借助它們徹底揭開神經(jīng)退行性疾病的神秘面紗，為無(wú)數(shù)患者帶來新的希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Parra-Damas A, Saura CA. Tissue Clearing and Expansion Methods for Imaging Brain Pathology in Neurodegeneration: From Circuits to Synapses and Beyond. Front Neurosci. 2020 Oct 5;14:914.
DOI：10.3389/fnins.2020.00914.