在探索生命奧秘的征程中，神經(jīng)生物學(xué)一直致力于解讀大腦的神秘密碼，從神經(jīng)元的精細(xì)結(jié)構(gòu)到復(fù)雜的神經(jīng)回路，從大腦的正常功能到神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制，每一個(gè)問(wèn)題都吸引著無(wú)數(shù)科研人員的目光。然而，受限于觀測(cè)技術(shù)，許多微觀層面的奧秘長(zhǎng)期以來(lái)深藏不露。直到單分子定位超分辨顯微技術(shù)出現(xiàn)，它如同神奇的鑰匙，為我們打開(kāi)了通往神經(jīng)生物學(xué)微觀世界的大門(mén)，讓許多曾經(jīng)模糊的景象變得清晰可見(jiàn)。
 

研究背景：技術(shù)新發(fā)現(xiàn)
突破光學(xué)衍射極限的神奇技術(shù)
單分子定位超分辨顯微技術(shù)的出現(xiàn)，成功突破了光學(xué)衍射極限的束縛，并誕生了多種具有代表性的技術(shù)。光激活定位顯微技術(shù)（PALM）利用光激活熒光蛋白的開(kāi)關(guān)特性，先激活稀疏熒光分子，再激發(fā)并捕捉圖像，通過(guò)多次重復(fù)和擬合確定分子位置來(lái)重建圖像。隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)（STORM）則使用有機(jī)熒光染料，通過(guò)染料分子間的能量傳遞實(shí)現(xiàn)開(kāi)關(guān)狀態(tài)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而完成超分辨成像。基于DNA的納米形貌成像點(diǎn)積累技術(shù)（DNA-PAINT）利用DNA鏈的特性，通過(guò)熒光標(biāo)記的寡核苷酸與DNA互補(bǔ)鏈的重復(fù)、瞬時(shí)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)熒光的開(kāi)啟和關(guān)閉，從而實(shí)現(xiàn)超分辨重構(gòu)，為科研人員提供了多樣化的研究手段。

三維視角下的微觀解析：3D-SMLM技術(shù)
細(xì)胞生活在三維空間中，傳統(tǒng)的二維成像技術(shù)無(wú)法滿足對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能精細(xì)化研究的需求，于是三維單分子定位技術(shù)（3D-SMLM）應(yīng)運(yùn)而生。它的核心在于將單分子的軸向信息通過(guò)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的平面形狀展現(xiàn)出來(lái)，主要原理可分四類。

提升成像質(zhì)量的關(guān)鍵：PSF擬合與像差分析
在3D-SMLM中，PSF定位的精度和準(zhǔn)確度對(duì)重構(gòu)圖像分辨率起著決定性作用。然而，在實(shí)際成像過(guò)程中，生物樣品會(huì)帶來(lái)像差。生物體內(nèi)細(xì)胞被多種物質(zhì)包圍，具有一定厚度，成像環(huán)境復(fù)雜，會(huì)改變熒光信號(hào)，扭曲單分子的形貌，影響定位精度和準(zhǔn)確度，導(dǎo)致三維重構(gòu)結(jié)構(gòu)失真。為了解決這一問(wèn)題，科研人員采用了兩種方法。

自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)通過(guò)測(cè)量像差，并利用變形鏡、空間光調(diào)制器等波前校正元件進(jìn)行校正，提高成像質(zhì)量，但由于設(shè)備限制，無(wú)法完全補(bǔ)償所有像差。原位點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)檢索方法（INSPR）則直接從單分子數(shù)據(jù)集中構(gòu)建PSF模型，成功捕捉厚生物樣本帶來(lái)的單分子形貌畸變，提升了定位精度。將自適應(yīng)光學(xué)和INSPR方法聯(lián)合使用，可以進(jìn)一步提高三維重構(gòu)的成像深度和質(zhì)量，為神經(jīng)生物學(xué)成像提供有力支持。

多色成像：微觀世界的多彩畫(huà)卷
多色單分子定位顯微鏡技術(shù)不僅能提供高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，還能分析不同目標(biāo)分子的空間結(jié)構(gòu)及其相互作用。多色成像的關(guān)鍵在于準(zhǔn)確區(qū)分和檢測(cè)目標(biāo)分子的顏色信息，根據(jù)采集方法不同，主要分為順序采集和同時(shí)采集兩大類。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用：在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)
神經(jīng)元的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析
神經(jīng)元是大腦功能的基本單元，其結(jié)構(gòu)和功能的研究一直是神經(jīng)生物學(xué)的重點(diǎn)。在神經(jīng)元周期性膜骨架方面，研究發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和血影蛋白在神經(jīng)元中發(fā)揮著重要作用。莊小威團(tuán)隊(duì)利用3D-STORM技術(shù)，在海馬神經(jīng)元細(xì)胞軸突上解析出周期性膜骨架的精細(xì)結(jié)構(gòu)，肌動(dòng)蛋白-帽蛋白復(fù)合物呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)均勻排布，血影蛋白四聚體連接在復(fù)合物環(huán)之間，構(gòu)成階梯狀長(zhǎng)程序列。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)在軸突、樹(shù)突、樹(shù)突棘等多個(gè)部位均存在，表明它是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞骨架的普遍特征，并且在神經(jīng)元的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)中具有重要意義。

突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的關(guān)鍵部位，與學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)功能密切相關(guān)。單分子定位超分辨顯微技術(shù)在突觸蛋白納米結(jié)構(gòu)域的研究中取得了豐碩成果。莊小威團(tuán)隊(duì)用多色3D-STORM方法確定了多種突觸蛋白之間的距離和空間關(guān)系。其他研究也發(fā)現(xiàn)了突觸后密度蛋白及其聚集的神經(jīng)遞質(zhì)受體的納米結(jié)構(gòu)域動(dòng)態(tài)變化，這些變化與突觸可塑性密切相關(guān)，有助于我們深入理解神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)的傳遞和突觸功能的調(diào)控機(jī)制。通過(guò)原位三維單分子定位超分辨顯微技術(shù)，科研人員可以繪制大腦神經(jīng)元單細(xì)胞水平的投射圖譜。

阿爾茲海默癥的研究新突破
淀粉樣斑塊是AD的主要病理特征之一，由Aβ蛋白異常聚集形成。科研人員利用技術(shù)對(duì)Aβ聚集過(guò)程和聚集物形態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)了Aβ斑塊內(nèi)纖維組織的高空間異質(zhì)性。研究還揭示了Aβ聚集體與突觸后受體結(jié)合后的毒性作用機(jī)制，為AD治療提供了新的策略方向。神經(jīng)原纖維纏結(jié)也是AD的重要病理特征，STORM技術(shù)詳細(xì)描繪了神經(jīng)原纖維纏結(jié)在神經(jīng)元胞體和軸突中的不同形態(tài)。對(duì)AD患者大腦中病理變化的精確位置和分布進(jìn)行研究至關(guān)重要，這些研究有助于我們理解AD的發(fā)生進(jìn)程，為疾病的診斷和治療提供關(guān)鍵信息。

應(yīng)用總結(jié)與前景
單分子定位超分辨顯微技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得了令人矚目的成果，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。神經(jīng)活動(dòng)是快速動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，需要更高的時(shí)間分辨率來(lái)捕捉；神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞種類繁多且相互作用復(fù)雜，需要更先進(jìn)的多色成像技術(shù)來(lái)區(qū)分不同細(xì)胞和分子；在研究大腦等神經(jīng)組織時(shí)，需要兼顧不同深度和視場(chǎng)的成像需求。未來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)將朝著復(fù)雜生物系統(tǒng)超分辨原位解析和定量生物分析工具兩個(gè)方向發(fā)展。在復(fù)雜生物系統(tǒng)研究中，先進(jìn)的分析方法將進(jìn)一步增強(qiáng)SMLM提供分子動(dòng)力學(xué)、空間組織和相互作用等信息的能力，幫助我們更精準(zhǔn)地解析生命現(xiàn)象。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
喬鈺媛, 張亦晴, 陳太龍, 曹健, 劉建麗, 徐帆. 單分子定位超分辨顯微技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)中的應(yīng)用（特邀）[J]. 中國(guó)激光, 2025, 52(09): 01.

DOI：10.3788/CJL241349.