肝細(xì)胞癌（HCC）作為最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，在中國(guó)發(fā)病率位居第三，死亡率在近十年內(nèi)更是飆升了50%。它不僅嚴(yán)重威脅患者的生命健康，也給醫(yī)療研究帶來(lái)諸多難題。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢測(cè)方法，如核磁共振成像（MRI）、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）和超聲成像等，都存在一定的局限性，難以精確地對(duì)HCC的微血管結(jié)構(gòu)和微環(huán)境功能進(jìn)行成像。而近年來(lái)，光聲成像技術(shù)嶄露頭角，為肝癌研究帶來(lái)了新的希望。今天，就讓我們一起深入了解這項(xiàng)神奇的技術(shù)，以及它在肝癌微血管研究中的重要作用。

研究背景
肝癌的嚴(yán)峻現(xiàn)狀與傳統(tǒng)檢測(cè)難題
正常情況下，肝臟細(xì)胞有序生長(zhǎng)和代謝，但當(dāng)肝細(xì)胞癌發(fā)生時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)不受控制地分裂，在肝臟內(nèi)部形成腫瘤。目前臨床常用的肝癌檢測(cè)手段中，MRI雖然能識(shí)別腫瘤位置，評(píng)估多種肝功能參數(shù)，但分辨率較低，無(wú)法對(duì)微小血管成像，且使用外源造影劑存在安全隱患；CT可以對(duì)腫瘤微小病灶成像，卻因使用電離輻射而增加了潛在的癌癥風(fēng)險(xiǎn)；超聲成像作為一種非入侵的成像技術(shù)，其準(zhǔn)確性很大程度上依賴(lài)于操作者的經(jīng)驗(yàn)。所以，迫切需要一種更先進(jìn)的技術(shù)來(lái)突破這些困境。

在實(shí)際操作中，研究人員選擇不同的激光激發(fā)肝臟血液的聲波信號(hào)。這是因?yàn)檠�紅蛋白分子與氧氣結(jié)合形成的含氧血紅蛋白與不含氧的脫氧血紅蛋白在這兩個(gè)波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)不同。利用這一特性，通過(guò)量化含氧血紅蛋白濃度和脫氧血紅蛋白濃度，就可以計(jì)算出血氧飽和度，從而評(píng)估腫瘤新生血管的氧水平。血氧飽和度是表征腫瘤微環(huán)境的重要指標(biāo)，因?yàn)檠鯕鈱?duì)于生命活動(dòng)至關(guān)重要，缺氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常、免疫調(diào)節(jié)失衡，甚至心肺功能下降，通過(guò)監(jiān)測(cè)血氧飽和度，有助于深入了解腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)和微環(huán)境變化。

多項(xiàng)研究已證實(shí)光聲成像在肝癌診斷方面取得了顯著成果。Yin等人利用光聲染料實(shí)現(xiàn)了HCC細(xì)胞特異性光聲成像；Zhou等人借助表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的靶向作用，成功提高了光聲技術(shù)對(duì)HCC的特異性檢測(cè)效率；Qi等人則利用光聲成像進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)量，準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)了腹腔內(nèi)HCC的診斷和治療。

基于光聲顯微成像的肝癌微血管研究實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)儀器與準(zhǔn)備
研究使用的高分辨率光聲顯微鏡（PAM）成像系統(tǒng)十分精密。由兩臺(tái)波長(zhǎng)獨(dú)立激光器提供光源，兩束脈沖激光經(jīng)過(guò)分束器耦合，再通過(guò)聚焦透鏡、針孔、鍍鋁反射鏡等一系列光學(xué)元件，最終被物鏡聚焦在樣品上激發(fā)超聲信號(hào)。超聲換能器負(fù)責(zé)采集反射回的光聲信號(hào)，而后利用放大器和數(shù)據(jù)采集卡將信號(hào)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)上進(jìn)行重建，整個(gè)過(guò)程中的數(shù)據(jù)采樣率、掃描步距和激光觸發(fā)均由計(jì)算機(jī)精準(zhǔn)控制。在實(shí)驗(yàn)前，科研人員先對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞放在培養(yǎng)箱中，在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行消化，利用離心機(jī)收集細(xì)胞，最后用細(xì)胞懸液，并與基質(zhì)膠混合備用。

小鼠肝細(xì)胞癌原位模型構(gòu)建
實(shí)驗(yàn)選用雄性裸鼠，飼養(yǎng)在26℃無(wú)特定病原體的環(huán)境中。構(gòu)建模型時(shí)，先對(duì)小鼠進(jìn)行消毒處理并麻醉，接著用無(wú)菌手術(shù)器械在小鼠腹部切開(kāi)約5mm的傷口，暴露肝葉。然后用接種針吸取20μL細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合物，注射到小鼠肝臟淺表，縫合傷口后注射抗生素觀(guān)察3天。在注射7天后，使用小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行成像，以此確定腫瘤位置。

腫瘤定位與成像分析
在進(jìn)行活體成像之前，將小鼠暴露在暗室中12h，再通過(guò)腹腔注射熒光素溶液。熒光素底物在小鼠體內(nèi)發(fā)生代謝反應(yīng)5min后，使用小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。通過(guò)觀(guān)察熒光素在小鼠體內(nèi)的分布情況，就能準(zhǔn)確確定腫瘤位置。之后，將活體成像數(shù)據(jù)導(dǎo)入圖像分析軟件進(jìn)行處理和分析。利用高分辨率光聲顯微鏡對(duì)小鼠的HCC組織和正常組織進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能成像。采集到的原始數(shù)據(jù)會(huì)導(dǎo)入到軟件中，通過(guò)反投影濾波重建和光譜分離算法，提取血管密度等參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：肝癌微血管的獨(dú)特特征
小動(dòng)物活體成像驗(yàn)證模型成功構(gòu)建
利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，通過(guò)調(diào)整對(duì)應(yīng)的濾光片，選擇生物發(fā)光模式進(jìn)行成像。在成像過(guò)程中，調(diào)整熒光圖像信號(hào)值范圍，能夠清晰地將熒光強(qiáng)度最大的區(qū)域定位為腫瘤的位置。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果有力地證明了HCC模型已成功構(gòu)建，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

而HCC模型鼠的肝表面PAM圖像則呈現(xiàn)出截然不同的景象。腫瘤邊界的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，血管扭曲；腫瘤旁邊的血管網(wǎng)絡(luò)比正常肝臟更復(fù)雜，肝靜脈形態(tài)異常，直徑變粗且排列不規(guī)則，出現(xiàn)多個(gè)分支和畸形小血管；腫瘤內(nèi)部血管呈蛛網(wǎng)狀向腫瘤中心生長(zhǎng)。對(duì)腫瘤組織周?chē)�及腫瘤中心的微血管直徑進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，正常小鼠右下肝葉位置的肝小葉血管直徑為15-20μm，而HCC鼠的癌旁小葉間肝靜脈分支直徑約為25μm，癌旁肝靜脈異常分支直徑分別為38μm和30μm，腫瘤中心血管直徑約為75μm，與正常血管相比，腫瘤血管直徑顯著增加。

腫瘤微血管密度與直徑特征改變
對(duì)光聲圖像進(jìn)行二值化處理后發(fā)現(xiàn)，與正常血管相比，癌變組織的血管密度整體減小。利用聚類(lèi)算法對(duì)血管進(jìn)行分類(lèi)，并沿同一水平線(xiàn)提取信號(hào)值統(tǒng)計(jì)血管直徑，結(jié)果顯示癌旁血管出現(xiàn)異常增生，血管直徑顯著增加，主要集中在0-40μm，而正常肝臟組織的血管直徑主要分布在0-20μm范圍內(nèi)。

肝癌微血管氧代謝功能異常
通過(guò)雙波長(zhǎng)圖像的像素值計(jì)算肝臟血管的血氧飽和度，結(jié)果顯示正常肝臟的血管結(jié)構(gòu)清晰，氧氣供應(yīng)充足，中央靜脈的血氧值比肝動(dòng)脈略低。但在腫瘤組織中，微血管的異常結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了血流的不均勻分布。癌旁肝小葉明顯低于正常肝小葉，腫瘤附近肝靜脈血液供應(yīng)不足造成周?chē)�組織缺氧，血管氧代謝能力降低。腫瘤中心的血管結(jié)構(gòu)不完整，新生細(xì)微分支較多，需要更多的氧氣供應(yīng)，比周?chē)�組織更低。

應(yīng)用總結(jié)與前景
在腫瘤微血管監(jiān)測(cè)方面，它能夠提供高分辨率的圖像，更準(zhǔn)確地檢測(cè)微小血管和異常血管的形態(tài)，大大提高早期癌癥檢測(cè)的準(zhǔn)確率。通過(guò)對(duì)圖像進(jìn)行分析，還可以評(píng)估微血管的密度、直徑等指標(biāo)，獲得腫瘤組織的氧合水平和代謝活性等信息，從而判斷腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)并預(yù)測(cè)腫瘤的惡性程度。目前，一些抗血管生成藥物已經(jīng)應(yīng)用于HCC的治療，這些藥物通過(guò)抑制腫瘤微血管的生長(zhǎng)、破壞已有的血管、阻斷血管通路等方式，減少腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移通路，達(dá)到抑制HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的。光聲成像技術(shù)能夠清晰地觀(guān)察腫瘤微血管的變化，為評(píng)估這些抗血管生成藥物的療效提供了有力的工具。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
孫彤, 黃國(guó)家, 張振輝. 基于高分辨光聲顯微成像的肝癌微血管特征分析[J]. 中國(guó)激光, 2023, 50(15): 1507105.
DOI：10.3788/CJL230615