眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在基因啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控基因的表達(dá)，是基因表達(dá)量改變最重要的調(diào)控方式。那轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系便成為研究的重點(diǎn)。本期文章我們將為大家?guī)��?lái)如何研究轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間對(duì)應(yīng)關(guān)系的方法，一起來(lái)看看吧。

一、啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子簡(jiǎn)介

啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列，一般我們研究時(shí)默認(rèn)選擇研究轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp作為啟動(dòng)子區(qū)域，因?yàn)榛�因的上游區(qū)域通常包含了基因的調(diào)控元件，而這些元件的作用范圍一般在2000bp以內(nèi)。

在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，由DNA產(chǎn)生具有特定編碼信息的RNA轉(zhuǎn)錄物。為確保基因在不同細(xì)胞和組織中表達(dá)的特異性，一組特定的蛋白質(zhì)通過(guò)選擇基因來(lái)調(diào)控轉(zhuǎn)錄，最終這些基因?qū)⒈晦D(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄本，這組蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的特定DNA序列結(jié)合，并在激活劑、共因子和RNA聚合酶等的配合下啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。目前發(fā)現(xiàn)，約1600個(gè)具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子。

在轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合的靶基因關(guān)系研究中，要么已知轉(zhuǎn)錄因子；要么已知靶基因；要么已有報(bào)道兩者都知道，想在自己的研究場(chǎng)景中進(jìn)行驗(yàn)證兩者的關(guān)系。下面我們就分門別類就這幾種情況下的研究方法和思路來(lái)做介紹。
二、尋找已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因

如果我們明確知道轉(zhuǎn)錄因子，想找其靶基因是誰(shuí)，也就是尋找已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因。首先，在開始正式實(shí)驗(yàn)以前，如果我們可以先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因的預(yù)測(cè)，那將會(huì)大大增加我們內(nèi)心的安全感和對(duì)結(jié)果的保證。預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)有很多，比如JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù), 通過(guò)軟件預(yù)測(cè)在基因的啟動(dòng)子序列上是否有對(duì)應(yīng)的motif, 從而識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。

又如TRRUST（https://www.grnpedia.org/trrust/Network_search_form.php），我們輸入轉(zhuǎn)錄因子的名稱后就可以得到其靶基因的信息，如我們?cè)赥RRUST數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找轉(zhuǎn)錄因子TEAD1的靶基因，我們把TEAD1輸入到search框中檢索，最終得到如下結(jié)果，我們可以看到該轉(zhuǎn)錄因子的靶基因目前有5個(gè)，分別是ATP6V0A2、MSLN、NAIP、PAX3和SRF。在網(wǎng)頁(yè)中點(diǎn)擊靶基因的名稱還可以看到該基因的具體信息。


然后，查閱文獻(xiàn)看是否有報(bào)道該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因。如果有文獻(xiàn)報(bào)道，我們想看在我們的研究背景下這種結(jié)合是否存在，那可以通過(guò)ChIP-qPCR、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)或者酵母單雜交技術(shù)來(lái)驗(yàn)證兩者的結(jié)合情況。如果沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)該轉(zhuǎn)錄因子的靶基因信息，那我們可以通過(guò)表觀組學(xué)手段ChIP-seq或者CUT&Tag技術(shù)來(lái)分析。這兩種方法的原理一樣，均是使用所研究的轉(zhuǎn)錄因子的抗體將轉(zhuǎn)錄因子及與之結(jié)合的基因組DNA復(fù)合物捕獲下來(lái)，后對(duì)捕獲得到的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，最終分析出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因。如果有些轉(zhuǎn)錄因子沒(méi)有合適的抗體，那可以使用加標(biāo)簽的辦法，把轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記后通過(guò)標(biāo)簽抗體進(jìn)行后續(xù)研究。不過(guò)研究到此并沒(méi)有結(jié)束，雜志投稿時(shí)還需要后續(xù)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，一般還需要通過(guò)ChIP-qPCR、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)或者酵母單雜交技術(shù)等方法來(lái)驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。

三、尋找調(diào)控某個(gè)已知基因的轉(zhuǎn)錄因子

這種情況與上面描述的情況正好相反，我們知道某一個(gè)基因，想篩選調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄因子，那可以通過(guò)以下方法來(lái)開展。首先，通過(guò)網(wǎng)站預(yù)測(cè)靶基因的轉(zhuǎn)錄因子。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子結(jié)合在基因的啟動(dòng)子區(qū)域，所以要預(yù)測(cè)該基因的轉(zhuǎn)錄因子，我們需要先找到該基因的啟動(dòng)子區(qū)域（這個(gè)方法在我們以前的一篇公眾號(hào)文章“ChIP-qPCR引物設(shè)計(jì)方法介紹”中有過(guò)介紹，這里就不再贅述，可點(diǎn)擊文末的文章鏈接查看~），得到該啟動(dòng)子序列后我們借助UCSC聯(lián)合JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)或PROMO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)（具體方法大家可以自己搜索一下，或者私信小編具體溝通，這里也不再贅述）。如下圖我們以人的TP53基因啟動(dòng)子序列為例做的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果，轉(zhuǎn)錄因子個(gè)數(shù)可通過(guò)設(shè)置JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)參數(shù)來(lái)調(diào)整。

這些預(yù)測(cè)只能給我們提供一些參考，如果通過(guò)這一步我們能得到明確的轉(zhuǎn)錄因子，那就可以通過(guò)ChIP-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR或者雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)層面的驗(yàn)證。如果通過(guò)預(yù)測(cè)我們沒(méi)有得到想要的結(jié)果，或者我們想通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選，這時(shí)我們可以進(jìn)行DNA pull-down實(shí)驗(yàn)或者酵母單雜交篩庫(kù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該實(shí)驗(yàn)是體外研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。大致原理是對(duì)感興趣的DNA序列設(shè)計(jì)生物素標(biāo)記的特異性DNA探針，并和與磁珠偶聯(lián)的鏈霉親和素結(jié)合。將該結(jié)合物與細(xì)胞核提取物一起孵育后純化與目標(biāo)DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)，將該蛋白洗脫后進(jìn)行后續(xù)的WB或者質(zhì)譜鑒定，從而得到與靶基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。
 
四、轉(zhuǎn)錄因子和靶基因均未知

在轉(zhuǎn)錄因子和靶基因均未知的情況下，我們是否可以研究?jī)烧邥r(shí)間的對(duì)應(yīng)關(guān)系呢？看到這個(gè)問(wèn)題肯定有些人比較好奇，我們就是研究它們之間的關(guān)系，現(xiàn)在兩個(gè)都不知道，如何開展研究呢？下面我們說(shuō)一個(gè)研究思路就可以解決這個(gè)問(wèn)題。

我們知道ATAC-seq的測(cè)序數(shù)據(jù)可以分析motif，這時(shí)再聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)ATAC-seq的motif分析尋找對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本相關(guān)基因的上游轉(zhuǎn)錄因子，從而可以挖掘靶基因與對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，然后可以進(jìn)一步通過(guò)ChIP-seq來(lái)驗(yàn)證前面兩種技術(shù)得到的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的調(diào)控關(guān)系。

如果在這個(gè)過(guò)程中我們得到了一個(gè)從沒(méi)被報(bào)道過(guò)是轉(zhuǎn)錄因子的蛋白，那我們需要進(jìn)行驗(yàn)證，證明其是轉(zhuǎn)錄因子。這時(shí)可以考慮進(jìn)行亞細(xì)胞定位（轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用時(shí)位于細(xì)胞核中）或者基于酵母雙雜交的轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證。

最后，我們把研究啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中常用的幾種方法匯總?cè)缦拢?br />  

方法	目的
雙熒光素實(shí)驗(yàn)	驗(yàn)證啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
酵母單雜交實(shí)驗(yàn)	驗(yàn)證啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
酵母單雜交篩庫(kù)	篩選已知啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子
ChIP-qPCR	驗(yàn)證啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
ChIP-seq/CUT&Tag	篩選已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因
DNA pull-down+質(zhì)譜（蛋白鑒定）	篩選已知啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子
亞細(xì)胞定位	驗(yàn)證蛋白是否是轉(zhuǎn)錄因子
酵母雙雜交的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)	驗(yàn)證蛋白是否是轉(zhuǎn)錄因子

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