眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在基因啟動子區(qū)域調(diào)控基因的表達(dá)，是基因表達(dá)量改變最重要的調(diào)控方式。那轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的對應(yīng)關(guān)系便成為研究的重點。本期文章我們將為大家?guī)�來如何研究轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間對應(yīng)關(guān)系的方法，一起來看看吧。

一、啟動子與轉(zhuǎn)錄因子簡介

啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列，一般我們研究時默認(rèn)選擇研究轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000bp作為啟動子區(qū)域，因為基因的上游區(qū)域通常包含了基因的調(diào)控元件，而這些元件的作用范圍一般在2000bp以內(nèi)。

在轉(zhuǎn)錄過程中，由DNA產(chǎn)生具有特定編碼信息的RNA轉(zhuǎn)錄物。為確�；�因在不同細(xì)胞和組織中表達(dá)的特異性，一組特定的蛋白質(zhì)通過選擇基因來調(diào)控轉(zhuǎn)錄，最終這些基因?qū)⒈晦D(zhuǎn)錄成RNA轉(zhuǎn)錄本，這組蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可與基因啟動子或增強子的特定DNA序列結(jié)合，并在激活劑、共因子和RNA聚合酶等的配合下啟動基因轉(zhuǎn)錄。目前發(fā)現(xiàn)，約1600個具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)錄因子。

在轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)合的靶基因關(guān)系研究中，要么已知轉(zhuǎn)錄因子；要么已知靶基因；要么已有報道兩者都知道，想在自己的研究場景中進(jìn)行驗證兩者的關(guān)系。下面我們就分門別類就這幾種情況下的研究方法和思路來做介紹。
二、尋找已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因

如果我們明確知道轉(zhuǎn)錄因子，想找其靶基因是誰，也就是尋找已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因。首先，在開始正式實驗以前，如果我們可以先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因的預(yù)測，那將會大大增加我們內(nèi)心的安全感和對結(jié)果的保證。預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因的數(shù)據(jù)庫有很多，比如JASPAR數(shù)據(jù)庫, 通過軟件預(yù)測在基因的啟動子序列上是否有對應(yīng)的motif, 從而識別轉(zhuǎn)錄因子的靶基因。

又如TRRUST（https://www.grnpedia.org/trrust/Network_search_form.php），我們輸入轉(zhuǎn)錄因子的名稱后就可以得到其靶基因的信息，如我們在TRRUST數(shù)據(jù)庫中尋找轉(zhuǎn)錄因子TEAD1的靶基因，我們把TEAD1輸入到search框中檢索，最終得到如下結(jié)果，我們可以看到該轉(zhuǎn)錄因子的靶基因目前有5個，分別是ATP6V0A2、MSLN、NAIP、PAX3和SRF。在網(wǎng)頁中點擊靶基因的名稱還可以看到該基因的具體信息。


然后，查閱文獻(xiàn)看是否有報道該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因。如果有文獻(xiàn)報道，我們想看在我們的研究背景下這種結(jié)合是否存在，那可以通過ChIP-qPCR、雙熒光素酶實驗或者酵母單雜交技術(shù)來驗證兩者的結(jié)合情況。如果沒有文獻(xiàn)報道過該轉(zhuǎn)錄因子的靶基因信息，那我們可以通過表觀組學(xué)手段ChIP-seq或者CUT&Tag技術(shù)來分析。這兩種方法的原理一樣，均是使用所研究的轉(zhuǎn)錄因子的抗體將轉(zhuǎn)錄因子及與之結(jié)合的基因組DNA復(fù)合物捕獲下來，后對捕獲得到的DNA片段進(jìn)行測序，最終分析出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因。如果有些轉(zhuǎn)錄因子沒有合適的抗體，那可以使用加標(biāo)簽的辦法，把轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記后通過標(biāo)簽抗體進(jìn)行后續(xù)研究。不過研究到此并沒有結(jié)束，雜志投稿時還需要后續(xù)的驗證數(shù)據(jù)，一般還需要通過ChIP-qPCR、雙熒光素酶實驗或者酵母單雜交技術(shù)等方法來驗證測序結(jié)果。

三、尋找調(diào)控某個已知基因的轉(zhuǎn)錄因子

這種情況與上面描述的情況正好相反，我們知道某一個基因，想篩選調(diào)控該基因的轉(zhuǎn)錄因子，那可以通過以下方法來開展。首先，通過網(wǎng)站預(yù)測靶基因的轉(zhuǎn)錄因子。因為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在基因的啟動子區(qū)域，所以要預(yù)測該基因的轉(zhuǎn)錄因子，我們需要先找到該基因的啟動子區(qū)域（這個方法在我們以前的一篇公眾號文章“ChIP-qPCR引物設(shè)計方法介紹”中有過介紹，這里就不再贅述，可點擊文末的文章鏈接查看~），得到該啟動子序列后我們借助UCSC聯(lián)合JASPAR數(shù)據(jù)庫或PROMO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測（具體方法大家可以自己搜索一下，或者私信小編具體溝通，這里也不再贅述）。如下圖我們以人的TP53基因啟動子序列為例做的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果，轉(zhuǎn)錄因子個數(shù)可通過設(shè)置JASPAR數(shù)據(jù)庫參數(shù)來調(diào)整。

這些預(yù)測只能給我們提供一些參考，如果通過這一步我們能得到明確的轉(zhuǎn)錄因子，那就可以通過ChIP-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR或者雙熒光素酶實驗等方法進(jìn)行實驗層面的驗證。如果通過預(yù)測我們沒有得到想要的結(jié)果，或者我們想通過實驗來篩選，這時我們可以進(jìn)行DNA pull-down實驗或者酵母單雜交篩庫來實現(xiàn)。該實驗是體外研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。大致原理是對感興趣的DNA序列設(shè)計生物素標(biāo)記的特異性DNA探針，并和與磁珠偶聯(lián)的鏈霉親和素結(jié)合。將該結(jié)合物與細(xì)胞核提取物一起孵育后純化與目標(biāo)DNA片段結(jié)合的蛋白質(zhì)，將該蛋白洗脫后進(jìn)行后續(xù)的WB或者質(zhì)譜鑒定，從而得到與靶基因結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。
 
四、轉(zhuǎn)錄因子和靶基因均未知

在轉(zhuǎn)錄因子和靶基因均未知的情況下，我們是否可以研究兩者時間的對應(yīng)關(guān)系呢？看到這個問題肯定有些人比較好奇，我們就是研究它們之間的關(guān)系，現(xiàn)在兩個都不知道，如何開展研究呢？下面我們說一個研究思路就可以解決這個問題。

我們知道ATAC-seq的測序數(shù)據(jù)可以分析motif，這時再聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，通過ATAC-seq的motif分析尋找對應(yīng)轉(zhuǎn)錄本相關(guān)基因的上游轉(zhuǎn)錄因子，從而可以挖掘靶基因與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，然后可以進(jìn)一步通過ChIP-seq來驗證前面兩種技術(shù)得到的轉(zhuǎn)錄因子和靶基因的調(diào)控關(guān)系。

如果在這個過程中我們得到了一個從沒被報道過是轉(zhuǎn)錄因子的蛋白，那我們需要進(jìn)行驗證，證明其是轉(zhuǎn)錄因子。這時可以考慮進(jìn)行亞細(xì)胞定位（轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用時位于細(xì)胞核中）或者基于酵母雙雜交的轉(zhuǎn)錄激活驗證。

最后，我們把研究啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的實驗設(shè)計中常用的幾種方法匯總?cè)缦拢?br />  

方法	目的
雙熒光素實驗	驗證啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
酵母單雜交實驗	驗證啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
酵母單雜交篩庫	篩選已知啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子
ChIP-qPCR	驗證啟動子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合
ChIP-seq/CUT&Tag	篩選已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因
DNA pull-down+質(zhì)譜（蛋白鑒定）	篩選已知啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子
亞細(xì)胞定位	驗證蛋白是否是轉(zhuǎn)錄因子
酵母雙雜交的轉(zhuǎn)錄激活實驗	驗證蛋白是否是轉(zhuǎn)錄因子

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