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小鼠胚胎成纖維細(xì)胞3T3-L1培養(yǎng)及經(jīng)典“雞尾酒”誘導(dǎo)攻略

瀏覽次數(shù):658 發(fā)布日期:2023-10-24  來(lái)源:absin

流行性肥胖是近幾年的一大健康挑戰(zhàn),肥胖促使一些心血管疾病如高血壓、血栓等發(fā)病率增高,糖尿病則是以高血糖為特征的代謝性疾病,長(zhǎng)期存在可導(dǎo)致各種組織,特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。3T3-L1細(xì)胞——小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(前脂肪細(xì)胞)系具有向脂肪細(xì)胞分化的特性,被廣泛用于研究糖尿病,肥胖癥等。
 

圖1 3T3-L1細(xì)胞形態(tài)

 

表1 3T3-L1基礎(chǔ)培養(yǎng)信息

細(xì)胞名稱(chēng)

3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)

來(lái)源

18 天左右胎齡的 Swiss 小鼠胚胎

生長(zhǎng)方式

貼壁生長(zhǎng)

細(xì)胞形態(tài)

成纖維細(xì)胞樣

培養(yǎng)條件

95%空氣、5%CO2、37℃

推薦營(yíng)養(yǎng)體系

DMEM(abs9483)+10% NBCS(abs978)+1%P/S(abs9244)

傳代

0.25%Try(abs47014937)消化5-15min 1:3-1:4傳代

凍存液配制

完全培養(yǎng)基+5%DMSO(abs9187)

 

培養(yǎng)小提示:


1)"Never allow culture to become completely confluent”。細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時(shí)進(jìn)行傳代;
2)為了避免細(xì)胞聚團(tuán),在等待細(xì)胞消化的過(guò)程中,不要通過(guò)擊打或搖晃瓶子來(lái)刺激細(xì)胞。難以消化的細(xì)胞可以放置在37℃;
3)正常培養(yǎng)(非脂肪誘導(dǎo)期)出現(xiàn)空泡時(shí),請(qǐng)優(yōu)先考慮環(huán)境壓力。造成壓力的原因包括培養(yǎng)基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌藥物、培養(yǎng)基中二氧化碳、碳酸氫鈉濃度不當(dāng)或培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡;
4)使用胎牛血清可能會(huì)造成細(xì)胞分化。!

 

3T3-L1成脂誘導(dǎo)“雞尾酒”策略


圖2 3T3-L1細(xì)胞(正常)和3T3-L1成脂分化后(對(duì)照)

 

一般認(rèn)為,細(xì)胞的增值和分化呈負(fù)相關(guān),細(xì)胞開(kāi)啟分化必先退出分裂增值周期,常用的方法就是讓其生長(zhǎng)至融合期,出現(xiàn)接觸抑制。脂肪生成是一個(gè)將碳水化合物和其他底物轉(zhuǎn)化為脂肪酸,然后作為T(mén)AGs(甘油三酯)儲(chǔ)存起來(lái)的過(guò)程。

 

經(jīng)典“雞尾酒”法中,胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)激活有絲分裂原蛋白激酶途徑誘導(dǎo)細(xì)胞分化、cAMP磷酸二酯酶抑制劑(IBMX)通過(guò)激活cAMP依賴(lài)性蛋白激酶途徑增強(qiáng)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ) 表達(dá)促進(jìn)成脂分化、地塞米松促進(jìn)C/EBPs的表達(dá)。

 

3T3-L1經(jīng)典成脂誘導(dǎo)過(guò)程

 

誘導(dǎo)步驟:將融合后的3T3-L1(匯合度100%)細(xì)胞從DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基切換到含有0.5mmol/L IBMX(abs817348)、10mg/mL胰島素和1μmol/L地塞米松的分化培養(yǎng)基中48h。然后將細(xì)胞維持在含有10%FBS和10 mg/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)基中48h,之后每隔一天更換常規(guī)新鮮培養(yǎng)基,一般第九天染色。

PS:不同產(chǎn)品活性純度不同,濃度僅供參考,不同誘導(dǎo)方案略有差異,IBMX(abs817348)用DMSO溶解時(shí)需要超聲破碎。

 

染色:油紅O儲(chǔ)存液與超純水按3:2稀釋混勻,過(guò)濾,避光靜置后酒紅色且無(wú)沉淀,現(xiàn)配現(xiàn)用,2h內(nèi)用完。

用PBS磷酸緩沖液小心漂洗細(xì)胞三次,以2mL/孔(六孔板)的劑量加入4%多聚甲醛,室溫固定40min,再用蒸餾水漂洗2次,每孔加入油紅O工作液1mL,常溫染色15min,蒸餾水漂洗至無(wú)殘?jiān),蒸餾水漂洗后加入PBS鏡下觀察。

PS:清洗細(xì)胞時(shí)動(dòng)搖要輕柔,防止脂滴脫落,油紅O工作液一定要過(guò)濾至無(wú)沉淀,否則染色后有殘?jiān)逸^難沖洗。!

 

“雞尾酒”誘導(dǎo)策略進(jìn)擊版

 

有研究者探索了葡萄糖濃度和誘導(dǎo)液2(含10mg/mL胰島素的低糖培養(yǎng)基)的作用時(shí)間對(duì)3T3L1細(xì)胞成脂分化率的影響,結(jié)果顯示,低糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)時(shí)成熟脂肪細(xì)胞形成率明顯增高,誘導(dǎo)液2作用時(shí)間為3d時(shí),成熟脂肪細(xì)胞形成率明顯高于其他組。



圖3 不同葡萄糖濃度對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂肪分化的影響
Figure2 Results of different time points during adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells


圖4 誘導(dǎo)劑II作用時(shí)間對(duì)3T3-L1細(xì)胞成脂肪分化的影響



圖5 3T3-L1細(xì)胞成脂肪分化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)果記錄(最優(yōu)條件下)

 

注:文中圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò),僅供學(xué)習(xí)參考用

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