節(jié)省基質(zhì)膠和成像清晰的血管生成實(shí)驗(yàn)方法詳解

瀏覽次數(shù)：712　發(fā)布日期：2023-9-8　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

實(shí)驗(yàn)原理：

腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。

無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長(zhǎng)直徑超過1~2 mm，都會(huì)有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長(zhǎng)迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。

體外的血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫哪M腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對(duì)這一過程的影響實(shí)驗(yàn)。我們以HUVEC細(xì)胞為例，介紹這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過程。

血管生成鏡檢圖

實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法：

試劑和緩沖液

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC，C-12203，PromoCell）
• IV膠原蛋白（354233，康寧）
• 0.05 M HCl （X942.1， Carl Roth）
• 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（促進(jìn)細(xì)胞，C-22010）
• PBS （14190144， Gibco）
• Accutase （A1110501， Gibco）
• 基質(zhì)膠®生長(zhǎng)因子降低，無酚紅（康寧® #356231），每孔10μl
•可選：鈣黃綠素AM（促銷因子，PK-CA707-80011）
設(shè)備

• µ-Slide 15 Well 3D，ibiTreat （81506，ibidi）

• 載玻片架（80003，ibidi）

• 用于檢查最佳凝膠體積的刻度紙

• 冰和冷卻架

• 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（移液器、無菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器等）

• 可選：多通道移液器

• 倒置顯微鏡（可選配熒光和適當(dāng)?shù)拟}黃綠素濾光片組染色）

實(shí)驗(yàn)方法：

實(shí)驗(yàn)流程介紹

血管生成實(shí)驗(yàn)流程

（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）

實(shí)驗(yàn)步驟

1.準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1）.實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4℃冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）

2）.開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3）.打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。

4）.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。

2.凝膠

1）.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

2）.準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。

3）.將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

4）.將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。

5）.等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

3.鋪細(xì)胞

加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。
1）.準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。

2）.將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3）.每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠�？梢允褂门艠�。
4）.同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
5）.蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

4.采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果

可以按照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像，并且對(duì)其成管長(zhǎng)度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5.免疫熒光染色

根據(jù)需要，可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。
1）.小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
2）.加入50μl用無血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
3）.在室溫下避光孵育30分鐘。
4）.使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。
5）.使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。