腫瘤微環(huán)境作為癌癥發(fā)展進(jìn)程中的關(guān)鍵角色，其內(nèi)部的復(fù)雜機(jī)制一直是科研人員聚焦的重點(diǎn)。一項(xiàng)發(fā)表于《Communications Biology》的研究成果，借助組織透明化技術(shù)，為我們開啟了深入了解腫瘤微環(huán)境的全新窗口，這一突破在癌癥研究領(lǐng)域掀起了新的波瀾。

研究背景與技術(shù)挑戰(zhàn)
腫瘤微環(huán)境由癌細(xì)胞、各種非轉(zhuǎn)化的基質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等）以及細(xì)胞外基質(zhì)組成。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間存在著復(fù)雜的相互作用。癌細(xì)胞可誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤血管生成、免疫逃逸等，而腫瘤微環(huán)境又為癌細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)、生長信號(hào)，幫助癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

傳統(tǒng)研究腫瘤微環(huán)境的方法存在諸多局限性。在體內(nèi)研究方面，由于組織的不透明性，很難對(duì)腫瘤微環(huán)境進(jìn)行整體、動(dòng)態(tài)的觀察。現(xiàn)有的成像技術(shù)，如磁共振成像（MRI）、計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）等，雖然能提供宏觀的解剖學(xué)信息，但分辨率不足以觀察細(xì)胞和分子水平的變化，而顯微鏡技術(shù)雖然分辨率高，但觀察深度有限，難以對(duì)深層組織進(jìn)行成像。因此，開發(fā)一種能夠突破這些限制的技術(shù)，對(duì)于深入理解腫瘤微環(huán)境的機(jī)制、推動(dòng)癌癥治療的發(fā)展至關(guān)重要。

技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用
該研究團(tuán)隊(duì)對(duì)組織透明化技術(shù)進(jìn)行了創(chuàng)新和優(yōu)化。組織透明化技術(shù)旨在使不透明的組織變得透明，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的三維成像。研究人員通過大量的化學(xué)篩選，開發(fā)出了一套新的組織透明化方案，使用了三種組織透明化試劑：CUBIC-P−、CUBIC-L和CUBIC-R+。

CUBIC-P−主要用于組織的脫色，它能有效去除組織中的色素，減少光吸收，使組織更易于透明化處理。CUBIC-L具有脫色和脫脂的雙重功能，它可以去除組織中的脂質(zhì)成分，進(jìn)一步提高組織的透明度。CUBIC-R+則用于調(diào)節(jié)組織的折射率，使組織的光學(xué)性質(zhì)更均勻，減少光散射，從而提高成像質(zhì)量。這三種試劑協(xié)同作用，能夠在一天內(nèi)實(shí)現(xiàn)小鼠多個(gè)器官（如肺、胰腺、脾臟等）的透明化，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。與以往的組織透明化方法相比，新方案不僅效率更高，而且對(duì)組織的損傷更小，能夠更好地保持組織的原有結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境的全面分析，研究人員將組織透明化技術(shù)與三維成像技術(shù)相結(jié)合。他們使用定制的光片熒光顯微鏡對(duì)透明化的組織進(jìn)行成像，能夠在不損傷組織的情況下，對(duì)整個(gè)器官進(jìn)行高分辨率的三維成像。為了覆蓋整個(gè)器官，顯微鏡的載物臺(tái)可以在橫向和軸向移動(dòng)，同時(shí)檢測(cè)物鏡也會(huì)同步移動(dòng)，以避免失焦。不同波長的激光可以激發(fā)不同的熒光標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種細(xì)胞成分的同時(shí)成像。通過這種方式，研究人員能夠獲取腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞和分子的三維空間信息。

為了更準(zhǔn)確地分析三維成像數(shù)據(jù)，研究人員引入了機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)。基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，如使用ilastik軟件進(jìn)行像素分類，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別不同的細(xì)胞成分。研究人員首先對(duì)圖像中的像素進(jìn)行手動(dòng)標(biāo)注，將其分為真實(shí)信號(hào)、Z軸信號(hào)泄漏、強(qiáng)自發(fā)熒光和背景熒光等不同類別。然后，ilastik軟件根據(jù)這些標(biāo)注的像素特征，計(jì)算每個(gè)像素屬于不同類別的概率。通過這種方式，能夠更準(zhǔn)確地對(duì)腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞成分進(jìn)行分割和分析，避免了傳統(tǒng)方法中因閾值設(shè)定不當(dāng)而導(dǎo)致的誤差。

成像實(shí)驗(yàn)與結(jié)果分析
利用優(yōu)化后的組織透明化和成像技術(shù)，對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行了深入研究。將人肺腺癌細(xì)胞通過靜脈注射的方式接種到裸鼠體內(nèi)，建立了肺轉(zhuǎn)移模型。在不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)小鼠的肺部進(jìn)行組織透明化處理和免疫染色，使用針對(duì)不同細(xì)胞成分的抗體。

通過三維成像，清晰地觀察到了腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞成分的空間分布。發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞在肺部形成了轉(zhuǎn)移性定植，并且與腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞緊密相鄰。通過測(cè)量癌細(xì)胞與不同細(xì)胞成分之間的距離，研究人員發(fā)現(xiàn)33%的癌細(xì)胞距離α-SMA陽性血管在10μm以內(nèi)，24%的癌細(xì)胞距離VEGFR3陽性血管在10μm以內(nèi)。這表明癌細(xì)胞與血管系統(tǒng)之間存在著密切的聯(lián)系，血管可能為癌細(xì)胞提供了營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移的途徑。還觀察到腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞和血小板也與癌細(xì)胞存在著相互作用，這些細(xì)胞的分布與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移定植可能密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）是一種多功能細(xì)胞因子，在腫瘤的發(fā)展過程中具有復(fù)雜的作用。通過實(shí)驗(yàn)探究了TGF-β對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植的影響，將TGF-β刺激和未刺激的癌細(xì)胞按照不同比例混合后注射到小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)混合注射TGF-β刺激和未刺激的癌細(xì)胞時(shí)，未刺激癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性定植數(shù)量明顯增加。當(dāng)未刺激癌細(xì)胞與TGF-β刺激癌細(xì)胞混合注射時(shí)，GFP陽性（未刺激癌細(xì)胞標(biāo)記）的菌落數(shù)量比單獨(dú)注射未刺激癌細(xì)胞時(shí)更多。這表明TGF-β刺激的癌細(xì)胞能夠促進(jìn)未刺激癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移定植。

為了探究TGF-β刺激的癌細(xì)胞促進(jìn)未刺激癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植的機(jī)制，研究人員進(jìn)行了RNA測(cè)序分析。結(jié)果顯示，TGF-β刺激癌細(xì)胞后，與凝血和炎癥相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β刺激的癌細(xì)胞能夠激活腫瘤微環(huán)境中的血小板和巨噬細(xì)胞。通過抗體標(biāo)記和成像分析，研究人員觀察到TGF-β刺激的癌細(xì)胞與血小板和巨噬細(xì)胞的共定位增加。在血小板實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TGF-β刺激的癌細(xì)胞周圍血小板的聚集明顯增多。在巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過細(xì)胞因子陣列分析發(fā)現(xiàn)，TGF-β刺激的癌細(xì)胞能夠促使肺部產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子能夠激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其向腫瘤微環(huán)境遷移。

深遠(yuǎn)意義與未來展望
研究借助創(chuàng)新的組織透明化技術(shù)，深入剖析了腫瘤微環(huán)境，為理解腫瘤發(fā)展機(jī)制提供關(guān)鍵依據(jù)。理論上，揭示了TGF-β重塑腫瘤微環(huán)境的機(jī)制，以及癌細(xì)胞與血小板、巨噬細(xì)胞的相互作用關(guān)系，加深了我們對(duì)腫瘤生物學(xué)的認(rèn)知。實(shí)踐中，研究成果為癌癥治療提供新靶點(diǎn)，針對(duì)TGF-β信號(hào)通路、血小板或巨噬細(xì)胞的干預(yù)，有望成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略，比如開發(fā)TGF-β抑制劑，或調(diào)節(jié)血小板、巨噬細(xì)胞功能來阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移定植。

在未來研究可將組織透明化技術(shù)與基因編輯、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等前沿技術(shù)深度融合。利用基因編輯修飾特定基因，探究其在腫瘤微環(huán)境中的功能，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，分析蛋白質(zhì)與代謝物分布變化，多層面揭示腫瘤發(fā)展本質(zhì)。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：Kubota, S.I., Takahashi, K., Mano, T. et al. Whole-organ analysis of TGF-β-mediated remodelling of the tumour microenvironment by tissue clearing. Commun Biol 4, 294 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-01786-y.