在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域，大腦就像一座神秘的城堡，吸引著無(wú)數(shù)科學(xué)家去探索其中的奧秘。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，由于技術(shù)的限制，想要清晰地觀察大腦內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活動(dòng)，就如同隔著一層迷霧。直到組織透明化技術(shù)和相關(guān)成像方法的出現(xiàn)，才讓這層迷霧逐漸散去，而iPEGASOS技術(shù)更是其中的佼佼者。今天，就讓我們一起走進(jìn)這一技術(shù)的奇妙世界，看看它是如何為大腦成像帶來(lái)革命性變化的。
 

研究背景
傳統(tǒng)大腦研究方法的困境
隨著研究的不斷深入，科研人員對(duì)多光子成像技術(shù)提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大視場(chǎng)、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技術(shù)不斷演進(jìn)，逐漸形成了超分辨成像、大視場(chǎng)成像、高速成像和深層成像等多個(gè)發(fā)展方向。這些發(fā)展方向相互交織，共同推動(dòng)著多光子成像技術(shù)向更高水平邁進(jìn)。

經(jīng)典的組織學(xué)方法，也就是依靠大腦切片來(lái)研究大腦結(jié)構(gòu)，一直是解剖神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)，這種方法存在著諸多問(wèn)題。一方面，由于組織不透明，光線很難穿透到大腦深層樣本中，為了克服這個(gè)問(wèn)題，科學(xué)家們嘗試將二維的大腦切片進(jìn)行數(shù)字化重建，試圖構(gòu)建出三維的大腦視圖，但可能出現(xiàn)誤差，而且在切片過(guò)程中還會(huì)對(duì)組織造成物理?yè)p傷，會(huì)影響高分辨率重建的準(zhǔn)確性。另一方面，整個(gè)切片、安裝、處理和掃描的過(guò)程非常繁瑣，不僅耗費(fèi)大量的人力和時(shí)間，還易出錯(cuò)。

組織透明化技術(shù)的興起
其實(shí)，組織透明化的嘗試早在一個(gè)世紀(jì)前就已經(jīng)開(kāi)始了，但真正得到廣泛關(guān)注和發(fā)展，還是得益于成像技術(shù)的進(jìn)步，比如光片顯微鏡的出現(xiàn)，能對(duì)整個(gè)小鼠大腦這樣的大樣本進(jìn)行單細(xì)胞分辨率的光學(xué)掃描�？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)整激光束和檢測(cè)平面的位置，獲取不同深度的光學(xué)切片，最后將這些切片組合起來(lái)，形成整個(gè)組織的三維重建圖像，讓我們能夠詳細(xì)地觀察到樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的空間組織。

隨著研究的深入，各種各樣的組織透明化方案不斷涌現(xiàn)。這些方案雖然使用的化學(xué)物質(zhì)不同，但基本原理是相似的，都包括組織固定、脫鈣（如果樣本包含骨頭）、脫色（去除內(nèi)源性色素）、脫脂（去除脂質(zhì)）以及折射率匹配（讓樣本和成像介質(zhì)的折射率一致，以達(dá)到最大透明度）等步驟。

iPEGASOS技術(shù)的誕生
盡管組織透明化技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但目前大多數(shù)透明化方案在與免疫標(biāo)記技術(shù)結(jié)合時(shí)還存在問(wèn)題。熒光報(bào)告基因常被用于可視化感興趣的分子，然而在透明化過(guò)程中，基于基因靶向方法的熒光信號(hào)強(qiáng)度通常會(huì)降低。有時(shí)候，即使使用轉(zhuǎn)基因和病毒輔助基因遞送，熒光信號(hào)在透明化后也可能變得非常微弱，甚至無(wú)法與背景噪聲區(qū)分開(kāi)來(lái)。而且，抗體很難穿透到整個(gè)大腦這樣的大組織的深層，限制了全腦標(biāo)記。

為了解決這些問(wèn)題，從兩種成熟的方案——iDISCO染色和PEGASOS透明化中汲取靈感，開(kāi)發(fā)出了iPEGASOS技術(shù)。不僅能讓組織具有出色的透明度，還能在長(zhǎng)達(dá)一年的時(shí)間里保持強(qiáng)大的熒光信號(hào)，并且能夠讓抗體深入穿透大型組織，包括整個(gè)小鼠大腦。

iPEGASOS技術(shù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備
在實(shí)驗(yàn)中，研究人員使用了多種成年小鼠。這些小鼠就像是不同的“研究模型”，每一種都有其獨(dú)特的特點(diǎn)，為研究提供了多樣化的視角。

iPEGASOS溶液制備：
脫色溶液用于去除樣本中的色素；脫脂溶液能有效去除脂質(zhì)；染色預(yù)處理溶液、通透溶液、封閉溶液、染色溶液等則在免疫染色過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，幫助抗體更好地與目標(biāo)結(jié)合；脫水溶液和透明介質(zhì)則用于脫水和提高樣本透明度，讓大腦樣本變得更加“清澈”。

iPEGASOS被動(dòng)浸泡程序：
固定后的腦組織要先清洗，然后依次浸泡在脫色溶液、脫脂溶液、通透溶液、封閉溶液、染色溶液中進(jìn)行免疫染色，之后還要進(jìn)行第二輪脫脂、脫水和透明化處理，最后才能進(jìn)行成像。而且，不同大小的樣本在各個(gè)步驟中的孵育時(shí)間也有所不同，都需要精確控制。

從大腦的背側(cè)到腹側(cè)，在不同深度的光學(xué)切片中都能觀察到豐富而強(qiáng)烈的信號(hào)，即使在光學(xué)像差最嚴(yán)重的腹側(cè)部分，也能實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率成像。通過(guò)對(duì)這些信號(hào)的分析和三維重建，我們能夠清晰地看到VIP神經(jīng)元細(xì)胞體及其相關(guān)過(guò)程，包括樹(shù)突的結(jié)構(gòu)。

實(shí)現(xiàn)完整小鼠大腦的神經(jīng)回路映射
為了深入了解大腦的神經(jīng)回路，研究人員使用病毒示蹤劑來(lái)標(biāo)記神經(jīng)回路。iPEGASOS技術(shù)在為注射了病毒示蹤劑的大腦提供了出色的信噪比，讓神經(jīng)元和神經(jīng)過(guò)程都能清晰成像。在這個(gè)過(guò)程中，不僅能夠觀察到起始細(xì)胞和單突觸輸入細(xì)胞的位置，還能清晰地看到軸突束和單個(gè)軸突的形態(tài)，甚至能夠追蹤單個(gè)軸突丘腦路徑，這對(duì)于理解神經(jīng)回路的連接和功能具有重要意義。

追蹤阿爾茨海默病小鼠模型中β-淀粉樣蛋白的積累
研究人員使用iPEGASOS技術(shù)對(duì)小鼠模型進(jìn)行研究，這是一種快速發(fā)展出明顯淀粉樣病理的小鼠模型。通過(guò)對(duì)不同年齡的小鼠大腦進(jìn)行免疫染色，使用抗體來(lái)檢測(cè)β-淀粉樣蛋白的沉積，該技術(shù)能夠清晰地捕捉到β-淀粉樣蛋白斑塊在大腦中的分布和隨年齡的變化。從6個(gè)月大開(kāi)始，β-淀粉樣蛋白斑塊就已經(jīng)出現(xiàn)在整個(gè)皮層，隨著年齡的增長(zhǎng)，斑塊逐漸積累并擴(kuò)散到其他腦區(qū)。而且，通過(guò)對(duì)信號(hào)強(qiáng)度和斑塊面積的量化分析，進(jìn)一步證實(shí)了該技術(shù)在追蹤β-淀粉樣蛋白積累方面的有效性，為研究阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制和治療提供了重要的工具。

iPEGASOS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)突破
保留熒光信號(hào)能力強(qiáng)
在小鼠腦切片實(shí)驗(yàn)中，iPEGASOS處理的樣本不僅保留了可見(jiàn)的內(nèi)源性GFP信號(hào)，免疫染色信號(hào)強(qiáng)度也更高。這表明iPEGASOS能更好地利用樣本已有的熒光信號(hào)，同時(shí)增強(qiáng)免疫染色效果。

成本效益和抗體兼容性好
與其他免疫染色策略相比，iPEGASOS采用增強(qiáng)樣本通透性的方法，使用常見(jiàn)且廉價(jià)的試劑，與標(biāo)準(zhǔn)的兩步間接熒光免疫染色過(guò)程兼容。這使其在成本效益和抗體兼容性方面優(yōu)勢(shì)明顯，且無(wú)需特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備，降低了實(shí)驗(yàn)門(mén)檻。

成像及樣本保存優(yōu)勢(shì)突出
與基于2D切片的3D重建技術(shù)相比，iPEGASOS結(jié)合光片顯微鏡成像，具有成像時(shí)間短、可多次成像、樣本保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。雖然PEGASOS存在組織收縮問(wèn)題，但iPEGASOS在一定程度上進(jìn)行了改善，并且能夠?qū)�厚組織進(jìn)行免疫染色，這是許多2D切片技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)驗(yàn)總結(jié)與展望
盡管iPEGASOS技術(shù)已經(jīng)取得了很大的成功，但仍然有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。比如，在成像配置方面，雖然研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了成像視角對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響不大，但對(duì)于一些需要精確比較全腦區(qū)域信號(hào)強(qiáng)度的研究，還需要探索更好的成像策略，以減少潛在的偏差。此外，隨著神經(jīng)科學(xué)研究的不斷深入，對(duì)于大腦結(jié)構(gòu)和功能的研究要求也越來(lái)越高。未來(lái)，iPEGASOS技術(shù)可能會(huì)與其他先進(jìn)技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步提高成像分辨率和對(duì)復(fù)雜神經(jīng)回路的解析能力。同時(shí)，在研究神經(jīng)退行性疾病等方面，iPEGASOS技術(shù)也有望為藥物研發(fā)和治療方案的制定提供更有力的支持。通過(guò)這項(xiàng)技術(shù)，我們能夠更清晰地觀察大腦的結(jié)構(gòu)和功能，深入了解神經(jīng)回路的奧秘，為神經(jīng)科學(xué)研究和相關(guān)疾病的治療帶來(lái)了新的希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Gao P, Rivera M, Lin X, Holmes TC, Zhao H, Xu X. Immunolabeling-compatible PEGASOS tissue clearing for high-resolution whole mouse brain imaging. Front Neural Circuits. 2024 Apr 17;18:1345692.
DOI: 10.3389/fncir.2024.1345692.