本文要點：目前，細胞焦亡逐漸成為是一種有效增強腫瘤免疫反應和抑制腫瘤生長的新方法，主要誘導方式依賴于化療藥物和光療，但它們潛在的生物毒性和光毒性限制了其在生物醫(yī)學中的應用。在此，研究者設計了一種近紅外-II發(fā)射的焦亡生物調諧器Rd-TTPA，它在超聲波照射下誘導焦亡，以實現(xiàn)焦亡增強聲動力治療（SDT）和腫瘤免疫原性細胞死亡（ICD）。得益于其A-π-D1-D2結構增強的供體-受體相互作用，Rd-TTPA可以在常氧（21%O2）和缺氧（2%O2）條件下通過超聲照射快速產生超氧自由基（O2-• ）誘導細胞焦亡。焦亡聲動力學生物鉆克服了化學藥物和光敏劑基焦亡長期存在的耐藥性和穿透深度有限等弱點。研究表明，Rd-TTPA可以選擇性靶向腫瘤細胞線粒體，并具有優(yōu)異的體內NIR-II熒光成像能力。在NIR-II熒光成像的指導下，用Rd-TTPA給藥荷瘤小鼠模型，通過焦亡增強SDT表現(xiàn)出令人滿意的抗腫瘤效果。

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研究者構建了一種新的A-π-D1-D2型分子Rd-TTPA，其具有增強的D-A相互作用和分子內運動，其中含有羅丹明支架作為電子受體（A）和π共軛體系，噻吩環(huán)和三苯胺單元分別作為第一和第二供體（D1，D2），以及可旋轉的乙烯基和C-C單鍵以增加分子內運動（方案1）。在超聲波照射下，Rd-TTPA可以在溶液中有效地產生大量的O2-•，使其能夠作為聲敏化劑。細胞和體內研究證明，Rd-TTPA可通過包含正電荷的結構主動靶向腫瘤細胞的線粒體，并通過SDT產生的ROS誘導細胞焦亡，通過焦亡增強SDT達到良好的抗腫瘤效果。Rd-TTPA還具有優(yōu)異的NIR-II熒光發(fā)射能力（λmax=1000 nm）和較大的斯托克斯位移（340 nm），這更有利于體內精確的腫瘤成像，有助于聯(lián)合治療。

方案1. 用于NIR-II成像引導的焦亡增強腫瘤SDT的超聲生物調諧器（Rd-TTPA）

首次通過紫外-可見吸收光譜和熒光光譜研究了Rd-TTPA和Rd-TPA的光學性質。這兩種化合物在不同極性的溶劑中表現(xiàn)出穩(wěn)定的吸收光譜（λabs=635–680）和發(fā)射光譜（λem=975–1000）。Rd-TTPA在DMF中的最大吸收帶位于660 nm，最大熒光發(fā)射帶位于1000 nm（圖1A）。對于Rd-TPA，吸收和發(fā)射最大值分別為358 nm和451 nm（圖1B）。與Rd-TPA相比，Rd-TTPA在1000 nm處顯示出更長的NIR-II熒光發(fā)射帶，以及340 nm的巨大斯托克斯位移。大的斯托克斯位移可以有效消除熒光探針自吸收和激發(fā)光譜與熒光光譜之間的串擾引起的熒光淬滅現(xiàn)象，提高探針的熒光成像信噪比（SNR），更有利于在生物成像中的應用。Rd-TTPA在PBS中的吸收峰和發(fā)射峰分別位于630 nm和940 nm處。Rd-TTPA的摩爾消光系數(shù)計算為3640 M-1 cm-1，這表明Rd TTPA在660 nm處具有一定的吸收能力。Rd-TTPA在二氯甲烷中的NIR-II熒光量子產率（QY）高達1.22%，這是參考NIR染料IR-26計算的（QY=0.05%，二氯乙烷），表明Rd-TTPA具有優(yōu)異的NIR-III窗口成像能力。

接下來，評估了Rd-TTPA在超聲（US）照射（3.0 MHz，1.0 W/cm2）下產生ROS的能力。使用DCFH作為溶液中的ROS熒光探針進行初步評估。如圖1C所示，在用Rd-TTPA處理的超聲波照射下，DCFH在530 nm處的熒光強度值隨著時間的增加（0-10分鐘）增加了約5.8倍，是相同條件下Rd-TTPA的2.0倍，超過了商用聲敏化劑亞甲基藍（MB）5.4倍。研究者通過使用DHR 123作為O2-•的指示劑和ABDA作為1O2的指示劑，測量了Rd-TTPA是否可以產生超氧自由基（O2-•）或單線態(tài)氧（1O2）。研究發(fā)現(xiàn)在超聲照射（3.0 MHz，1.0 W/cm2）下，用Rd-TTPA處理的DHR 123的熒光強度（535 nm）隨著照射時間的變化增加了近8.5倍（圖1D和E），而ABDA在380 nm處的UV-Vis吸收值沒有顯著變化（圖1F）。更重要的是，相對于單獨的DHR123，即使在360秒的相對較短的暴露時間內，也觀察到Rd-TTPA的熒光增強約為7.5倍。考慮到這些發(fā)現(xiàn)，它支持Rd-TTPA在超聲波照射下能產生大量O2，但不能產生1O2。

研究者評估了Rd-TTPA使用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）在細胞中產生ROS的能力，在ROS存在的情況下，DCFH DA可以被細胞內酯酶立即分解并氧化為發(fā)射2′，7'-二氯熒光素（DCF）。Rd-TTPA在488 nm處沒有明顯的吸收，其熒光強度遠弱于在相同波長488 nm處激發(fā)的DCF。這些結果表明，Rd-TTPA不會干擾細胞內DCF的綠色熒光信號。如圖1G所示，在Rd-TTPA存在的情況下，超聲照射下4T1細胞出現(xiàn)亮綠色熒光信號，熒光強度是Rd-TTPA組的8.1倍和US組的6.2倍，表明Rd TTPA具有優(yōu)異的聲動力學特性。對于用Rd-TTPA處理并用超聲波照射的4T1細胞，在激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）下觀察到二氫乙錠（DHE，細胞O2-•的指示劑）的特征性紅色熒光（圖1H）。相比之下，在Rd-TTPA組或US照射組中沒有觀察到明顯的紅色熒光信號。

圖2. Rd-TTPA的亞細胞分布和體外抗腫瘤作用

如圖2A–C所示，Rd-TTPA的紅色通道熒光與MTG（商業(yè)線粒體染料）的綠色熒光很好地融合，而Hoechst 33342的藍色熒光僅能染色細胞核。Rd-TTPA與MTG的Pearson系數(shù)為0.90，而Rd-TTPA和Hoechst 33342為0.13（圖2B），表明探針主要靶向線粒體。相比之下，Rd-TTPA對LTG（商業(yè)溶酶體染料）的皮爾遜系數(shù)僅為0.57（圖2B），證實了Rd-TTPA靶向線粒體的潛力。

采用MTT法評價Rd-TTPA的體外抗腫瘤作用。如圖2D所示，在沒有超聲波照射的情況下，Rd-TTPA的毒性可以忽略不計，即使Rd-TTPA濃度升至30μM，細胞存活率仍可達90%。然而，在超聲照射下，4T1細胞的活性隨著Rd-TTPA濃度的增加而降低。Rd-TTPA+US組的IC50值為7.88μM。此外，使用通過活細胞和死細胞染色（鈣黃綠素AM和PI）結果證明了Rd-TTPA在體外具有優(yōu)異的抗腫瘤活性。如圖2E所示，包括Rd-TTPA組和US組在內的對照組中僅出現(xiàn)綠色熒光信號，表明Rd-TTPA的細胞毒性可以忽略不計，超聲波照射對細胞存活率的影響微不足道。然而，在Rd-TTPA+US組中，有一半的細胞顯示出強烈的紅色熒光信號，而綠色熒光信號則急劇下降，這表明Rd-TTPA可以作為一種有效的聲增敏劑來導致細胞死亡。這些結果證明，Rd-TTPA在細胞中具有優(yōu)異的聲動力學抗腫瘤活性。

圖3. 評價Rd-TTPA誘導細胞焦亡的能力

細胞焦亡是由GSDM蛋白家族介導的，該家族包含一個C端抑制結構域和一個N端成孔結構域，后者在炎癥性胱天蛋白酶激活后釋放，可以在細胞膜上形成孔，導致細胞膜破裂和焦亡的發(fā)生。研究者首先使用LSCM觀察了超聲照射下與Rd-TTPA孵育的4T1細胞的形態(tài)變化。在超聲波照射10分鐘后，發(fā)現(xiàn)只有用Rd-TTPA處理的4T1細胞形成了一些氣泡狀突起，稱為細胞質膜染色染料DIO染色的焦亡體（圖3A）。此外，Hoechst 33342染色結果顯示，在這個過程中，細胞核保持完整，而不是分裂（凋亡的一個標志），這與細胞焦亡的典型特征一致。相比之下，對照細胞沒有發(fā)現(xiàn)氣泡狀突起，細胞僅用Rd TTPA或超聲波照射處理。因此，研究者認為Rd-TTPA可以在SDT下充當焦亡生物調諧器。為了進一步揭示焦亡激活的途徑，對不同處理的4T1細胞進行了蛋白質印跡分析。Caspase-1/Gasdermin-D（GSDMD）被認為是焦亡起始的主要途徑。在Rd-TTPA+US組中，caspase-1和GSDMD-N片段的表達水平顯著，而在對照組、Rd-TTPA組和US組中沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。Western blot結果表明，超聲誘導的O2-•產生通過胱天蛋白酶-1/GSDMD途徑啟動了細胞焦亡（圖3B-D）。由于焦亡過程中產生的GSDMD-N可以觸發(fā)膜孔的形成并導致IL-1β等炎性細胞因子的釋放，因此測量了各組細胞培養(yǎng)基中IL-1β的相對釋放量。Rd-TTPA+US組的IL-1β含量高于其他組，這與GSDMD觸發(fā)細胞膜孔的預期一致（圖3E）。此外，隨著膜孔的形成，細胞內乳酸脫氫酶（LDH）可能會逐漸釋放到細胞外液中，還確定了各組LDH的滲漏情況。與其他組相比，Rd-TTPA+US組LDH的釋放增加更為顯著（圖3F）。這些結果表明，基于Rd TTPA的SDT可以啟動caspase-1/GSDMD通路，誘導細胞膜孔的形成，進一步促進細胞焦亡的發(fā)生。

研究表明，細胞焦亡可以啟動腫瘤特異性免疫，從而介導免疫原性細胞死亡（ICD），是增強腫瘤免疫治療的有力策略�？梢酝ㄟ^檢測兩個重要標志物CRT和HGMB-1的表達來評估Rd-TTPA誘導細胞焦亡增強ICD的能力。此后，與Rd-TTPA共孵育的4T1細胞在超聲照射下在細胞表面顯示出顯著增加的CRT信號，表明細胞焦亡過程中細胞表面CRT含量增加（圖3G）。除CRT外，其他組僅在細胞核中檢測到HMGB1，而在超聲照射下與Rd-TTPA共孵育的4T1細胞中，HMGB1的表達遷移到整個細胞中。Rd-TTPA+US組細胞質中ATP含量也顯著增加。這些結果表明，在超聲照射下，Rd-TTPA誘導的細胞焦亡有效地導致ICD并引發(fā)適應性免疫反應。

圖4. Rd-TTPA在缺氧條件下的抗腫瘤作用

腫瘤缺氧可增強腫瘤對基于ROS的癌癥療法（如PDT和SDT）的抵抗力，導致治療效果降低。因此，通過在三氣體培養(yǎng)箱中創(chuàng)造缺氧條件模擬腫瘤缺氧微環(huán)境，從而評估Rd-TTPA是否可以在缺氧條件下誘導焦亡并介導抗腫瘤作用（2%O2，圖4A）。DCFH-DA用于評估Rd TTPA在缺氧條件下（含氧量：2%）產生ROS的能力。與Rd-TTPA一起孵育的缺氧4T1細胞顯示出DCF的獨特綠色熒光特征，而其他組沒有出現(xiàn)顯著變化（圖4D）。此外，還通過DHE染色評估了Rd-TTPA在缺氧條件下產生O2-•的能力。

在超聲照射下，缺氧的Rd-TTPA負載的4T1細胞中呈現(xiàn)出明亮的紅色熒光，而其他組則顯示出稀少的紅色熒光（圖4D）。Rd-TTPA的缺氧SDT結果與其在常氧條件下的ROS產生曲線一致，證明了Rd-TTPA通過O2依賴性SDT在缺氧腫瘤中起作用的可行性。MTT法用于評估Rd-TTPA的抗腫瘤效率。如圖4B所示，在缺氧條件下，Rd-TTPA對4T1細胞的細胞毒性可以忽略不計。在超聲照射下，Rd-TTPA在低氧（2%O2）條件下顯示出對癌癥細胞的劑量依賴性根除，IC50值（最大抑制濃度的一半）為9.92μM，僅略低于正常氧氣條件下的IC50（21%O2條件下IC50=7.88μM，圖4C）。隨后，活細胞/死細胞染色更直觀地證實了Rd-TTPA在缺氧條件下對4T1細胞具有良好的殺傷作用（圖4F）。為了研究Rd-TTPA在缺氧條件下是否能有效激活焦亡，通過LSCM觀察了細胞的形態(tài)變化。在超聲照射下與Rd-TTPA一起孵育的缺氧4T1細胞表現(xiàn)出明顯的細胞形態(tài)變化，包括細胞膜溶解和焦亡體形成（圖4E），這與常氧條件下的焦亡特征相似（圖4A）。因此，研究者得出結論，即使在缺氧環(huán)境中，Rd-TTPA也能誘導焦亡，這可能是由于基于SDT的O2-•發(fā)生器和焦亡誘導劑Rd-TTPA在超聲波照射下通過一種不依賴O2的治療途徑產生O2-•。Rd-TTPA的這種獨特特性使其成為治療深部和缺氧性腫瘤的有價值的治療方法。

圖5. Rd-TTPA的體內抗腫瘤作用

鑒于Rd-TTPA在體外具有出色的NIR-II熒光發(fā)射，使用NIR-II體內圖像系統(tǒng)研究了Rd-TTPA的腫瘤積累和體內成像能力。首先，在腫瘤內注射Rd-TTPA 0-48小時后，小鼠腫瘤中1000 nm長通（LP）通道的熒光幾乎沒有明顯變化（圖5C），表明其具有優(yōu)異的NIR-II成像能力和Rd-TTPA在腫瘤中的長保留時間。靜脈注射Rd-TTPA后，腫瘤部位的NIR-II熒光亮度隨時間增加，在8小時達到最大強度，96小時的熒光信號仍然明亮�；铙w結果表明，Rd TTPA可以靶向并集中在腫瘤中，并且具有較長的腫瘤保留時間（約96小時），這有利于腫瘤的特異性NIR-II熒光成像和活體小鼠的成像引導SDT。

鑒于其在細胞和體內的優(yōu)異性能，研究者通過焦亡增強SDT進一步證明了Rd-TTPA對4T1荷瘤小鼠的抗腫瘤作用。首先，通過將4T1細胞皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右后肢建立4T1腫瘤攜帶模型（圖5A）。然后，用不同的治療方法治療荷瘤小鼠：（i）PBS，（ii）Rd-TTPA，（iii）US和（iv）Rd-TTPA+US，每2天一次，并監(jiān)測和記錄腫瘤體積14天。Rd-TTPA+US組的皮下腫瘤在14天的SDT治療后沒有明顯生長，而其他組的腫瘤體積在視覺上有所增大，這表明Rd-TTPA可以通過SDT有效抑制腫瘤生長（圖5B和D）。同時，各組荷瘤小鼠在不同治療14天后體重沒有顯著變化，表明Rd-TTPA不影響小鼠的存活和生長（圖5F）。隨后，通過組織學研究證實了Rd-TTPA的抗腫瘤作用。腫瘤組織切片的蘇木精和伊紅（H&E）染色表明，對照組和另外兩組（僅Rd TTPA和僅US）的細胞形態(tài)正常，而Rd-TTPA+US組的腫瘤細胞明顯被破壞，表明基于Rd-TTPA的SDT具有出色的抗腫瘤效力，Ki-67染色進一步證實了這一點（圖5G）。與對照組相比，Rd-TTPA+US組腫瘤組織中胱天蛋白酶-1和GSDMD-N的表達含量顯著上調，表明SDT治療腫瘤時發(fā)生了焦亡（圖5E）。

總之，研究者創(chuàng)建了一種具有NIR-II發(fā)射的小分子焦亡生物調諧器Rd-TTPA，以在NIR-II熒光成像的指導下實現(xiàn)焦亡增強聲動力腫瘤治療。A-π-D1-D2型結構增強了供體-受體相互作用，有利于Rd-TTPA的分子內電荷轉移和三重態(tài)形成，促進了其聲動力學和NIR-II熒光性能。在超聲波照射下，Rd-TTPA通過大量O2-•的產生誘導腫瘤細胞焦亡。Western Blot研究進一步揭示，Rd-TTPA介導的焦亡機制涉及Caspase-1/GSDMD通路。即使在缺氧條件下（2%O2），Rd-TTPA也能誘導焦亡并有效消融腫瘤細胞，表明SDT介導的焦亡是低O2依賴性的。體內腫瘤治療揭示了Rd TTPA通過焦亡增強SDT和ICD的優(yōu)異抗腫瘤作用。因此，本研究為設計一種聲動力學生物調諧器提供了一種有前景的策略，用于通過NIR-II成像引導的SDT激活實體瘤的焦亡，并將推動新型聲敏化劑在腫瘤治療中的開發(fā)和應用。

 

參考文獻

Wang X, Chi W, Wu J, et al. A NIR-II emissive sonosensitized biotuner for pyroptosis-enhanced sonodynamic therapy of hypoxic tumors[J]. Biomaterials, 2025, 315: 122969.
 

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