多光子成像在生物醫(yī)學(xué)特別是腦科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，為深層生物組織結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)研究提供了非侵入性和非破壞性的成像手段。生物組織的吸收和強(qiáng)散射特性限制了成像深度。近年來(lái)，得益于原理及技術(shù)上的進(jìn)步，多光子成像在活體生物中的成像深度顯著提高。其中，1700nm波段激發(fā)的多光子成像顯著降低組織吸收及散射，與其他激發(fā)波段相比獲得了目前最大的成像深度。

多光子成像技術(shù)背景研究
技術(shù)的誕生與發(fā)展
自20世紀(jì)90年代康奈爾大學(xué)Denk等首次成功演示雙光子激光掃描顯微成像技術(shù)，多光子成像技術(shù)便在生命科學(xué)領(lǐng)域嶄露頭角。這項(xiàng)技術(shù)以其深層穿透（毫米量級(jí)）、非侵入式且無(wú)損、高空間分辨率（亞微米量級(jí)）以及強(qiáng)大的功能成像和動(dòng)力學(xué)追蹤能力，迅速在眾多生命科學(xué)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。從復(fù)雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的描繪，到疾病的精準(zhǔn)診斷；從神經(jīng)細(xì)胞功能的深入探究，到血流變化的精確測(cè)量，多光子成像技術(shù)為科研工作者提供了前所未有的研究視角。

隨著研究的不斷深入，科研人員對(duì)多光子成像技術(shù)提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大視場(chǎng)、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技術(shù)不斷演進(jìn)，逐漸形成了超分辨成像、大視場(chǎng)成像、高速成像和深層成像等多個(gè)發(fā)展方向。這些發(fā)展方向相互交織，共同推動(dòng)著多光子成像技術(shù)向更高水平邁進(jìn)。

深層成像面臨的挑戰(zhàn)
在多光子成像技術(shù)的發(fā)展歷程中，深層成像一直是備受關(guān)注的重點(diǎn)領(lǐng)域。然而，生物組織的復(fù)雜特性卻為深層成像帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。生物組織的結(jié)構(gòu)極不均勻，這使得激發(fā)光在其中傳播時(shí)會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的散射。同時(shí)，生物組織對(duì)激發(fā)光的吸收現(xiàn)象也較為顯著，對(duì)于絕大多數(shù)組織而言，主要是水吸收。這兩種因素疊加在一起，導(dǎo)致激發(fā)光功率隨著成像深度的增加而呈指數(shù)衰減。

以活體動(dòng)物腦成像為例，常用的鈦寶石激光器在775nm波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，活體小鼠腦血管的雙光子熒光成像深度僅能達(dá)到腦表面下650μm，這一深度在解剖學(xué)上僅對(duì)應(yīng)于灰質(zhì)層。若要深入研究腦部的白質(zhì)層和海馬體等更深層結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的成像技術(shù)就顯得力不從心。為了突破這一限制，科研人員嘗試了插入光學(xué)探針、使用顯微內(nèi)窺鏡或者移除大腦灰質(zhì)層等方法，但這些方法都違背了多光子成像無(wú)損、非侵入的優(yōu)點(diǎn)。

第二種策略：是采用更高階非線性激發(fā)，如三光子成像。這種成像方式能夠進(jìn)一步抑制表面背景信號(hào)，顯著提高深層的信號(hào)背景比。利用1665nm激發(fā)三光子熒光，科研人員實(shí)現(xiàn)了腦表面下2100μm的深層腦血管成像，這也是目前最深的多光子腦成像。而且，深層信號(hào)背景比達(dá)到46，顯示出三光子成像在深層成像方面的巨大潛力。

在眾多長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)波段中，1700nm波段憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)脫穎而出，成為了科研人員關(guān)注的焦點(diǎn)。它在降低組織吸收和散射方面表現(xiàn)優(yōu)異，具有較大的有效衰減長(zhǎng)度，理論上能夠?qū)崿F(xiàn)比其他波段更深的成像深度，為深層生物組織成像帶來(lái)了新的希望。

1700nm波段多光子成像的原理剖析
多光子顯微成像的神奇原理
1700nm波段多光子成像技術(shù)的基礎(chǔ)是多光子顯微成像原理，這一原理基于非線性光學(xué)效應(yīng)，展現(xiàn)出令人驚嘆的微觀成像能力。單光子熒光和多光子熒光在產(chǎn)生機(jī)制上有著顯著的區(qū)別。單光子熒光在整個(gè)激發(fā)光通路上都會(huì)產(chǎn)生；而多光子熒光則多個(gè)激發(fā)光子與物質(zhì)相互作用，這種非線性的相互作用使得只有在焦點(diǎn)處才會(huì)產(chǎn)生顯著的熒光信號(hào)。

這種特性賦予了多光子顯微成像獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它不僅具有本征的三維成像能力，能夠在三維空間中精準(zhǔn)定位目標(biāo)，還具備亞微米量級(jí)的高分辨率，能夠清晰分辨微觀結(jié)構(gòu)，以及毫米量級(jí)的成像深度，可深入生物組織內(nèi)部進(jìn)行觀測(cè)。多光子顯微成像利用近紅外波段激發(fā)，巧妙地減少了組織散射的影響，大大降低了激發(fā)光在傳輸過(guò)程中的損耗，使其能夠?qū)崿F(xiàn)深層生物組織成像。

1700nm波段多光子成像的應(yīng)用場(chǎng)景
活體小鼠深層腦血管成像
腦血管成像在深層腦成像中占據(jù)著重要地位，大腦中的血管為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)清除代謝產(chǎn)物，對(duì)維持大腦正常功能起著關(guān)鍵作用。2013年，康奈爾大學(xué)Xu團(tuán)隊(duì)利用棒狀光纖孤子自頻移獲得的1675nm孤子光源，首次實(shí)現(xiàn)了活體小鼠白質(zhì)層的三次諧波成像（無(wú)標(biāo)記）和海馬體三光子熒光血管成像，成像深度達(dá)到1340μm，開(kāi)啟了1700nm波段多光子成像在腦血管成像領(lǐng)域的探索之旅。此后，科研人員不斷優(yōu)化飛秒脈沖孤子光源，提升成像深度和效果，實(shí)現(xiàn)了活體小鼠腦表面下2100μm的深層血管成像，這也是目前1700nm波段激發(fā)活體動(dòng)物三光子熒光成像的最大成像深度，相比最初的成像深度有了顯著提升。

1700nm波段激發(fā)不僅在三光子成像中表現(xiàn)出色，在雙光子成像方面也有出色表現(xiàn)。此外，科研人員還發(fā)現(xiàn)1700nm波段雙光子熒光血管成像已接近理論極限，而三光子熒光血管成像仍有很大的發(fā)展空間。

髓鞘是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，手指皮膚結(jié)構(gòu)異常與神經(jīng)病變密切相關(guān)。He等人利用1700nm波段三光子熒光成像，結(jié)合特異性熒光染料標(biāo)記手指皮膚髓鞘，實(shí)現(xiàn)了皮膚表面下340μm髓鞘成像。此外，由于外源性熒光標(biāo)記物存在毒性和光漂白問(wèn)題，無(wú)標(biāo)記三次諧波成像在皮膚成像中愈發(fā)重要。髓鞘富含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，能產(chǎn)生強(qiáng)三次諧波信號(hào)，利用1700nm波段三光子成像研究小鼠趾部皮膚髓鞘結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記三次諧波成像與三光子熒光成像共定位，可實(shí)現(xiàn)皮膚深層髓鞘成像，且具有無(wú)標(biāo)記和不受光漂白影響的優(yōu)勢(shì)。

總結(jié)與展望
盡管1700nm波段多光子成像技術(shù)已取得顯著進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，該波段激發(fā)三光子熒光成像的成像深度受激發(fā)光源和熒光標(biāo)記物的限制，僅能達(dá)到2100μm。在腦細(xì)胞成像和腦細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究方面，該技術(shù)也存在局限性。結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)，通過(guò)矯正生物組織導(dǎo)致的光波波前畸變，有望進(jìn)一步提升活體生物成像深度和分辨率。開(kāi)發(fā)近紅外波段的高亮度熒光探針也是關(guān)鍵方向之一。近紅外熒光探針具有光損傷小、深層組織穿透能力強(qiáng)、對(duì)生物樣品中生物分子背景自發(fā)熒光干擾小等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)更深層的組織成像。

DOI：10.3788/LOP232274