在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域，大腦就像一座神秘的城堡，吸引著無數(shù)科學(xué)家去探索其中的奧秘。然而，長期以來，由于技術(shù)的限制，想要清晰地觀察大腦內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和細胞活動，就如同隔著一層迷霧。直到組織透明化技術(shù)和相關(guān)成像方法的出現(xiàn)，才讓這層迷霧逐漸散去，而iPEGASOS技術(shù)更是其中的佼佼者。今天，就讓我們一起走進這一技術(shù)的奇妙世界，看看它是如何為大腦成像帶來革命性變化的。
 

研究背景
傳統(tǒng)大腦研究方法的困境
隨著研究的不斷深入，科研人員對多光子成像技術(shù)提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大視場、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技術(shù)不斷演進，逐漸形成了超分辨成像、大視場成像、高速成像和深層成像等多個發(fā)展方向。這些發(fā)展方向相互交織，共同推動著多光子成像技術(shù)向更高水平邁進。

經(jīng)典的組織學(xué)方法，也就是依靠大腦切片來研究大腦結(jié)構(gòu)，一直是解剖神經(jīng)科學(xué)研究的基礎(chǔ)，這種方法存在著諸多問題。一方面，由于組織不透明，光線很難穿透到大腦深層樣本中，為了克服這個問題，科學(xué)家們嘗試將二維的大腦切片進行數(shù)字化重建，試圖構(gòu)建出三維的大腦視圖，但可能出現(xiàn)誤差，而且在切片過程中還會對組織造成物理損傷，會影響高分辨率重建的準確性。另一方面，整個切片、安裝、處理和掃描的過程非常繁瑣，不僅耗費大量的人力和時間，還易出錯。

組織透明化技術(shù)的興起
其實，組織透明化的嘗試早在一個世紀前就已經(jīng)開始了，但真正得到廣泛關(guān)注和發(fā)展，還是得益于成像技術(shù)的進步，比如光片顯微鏡的出現(xiàn)，能對整個小鼠大腦這樣的大樣本進行單細胞分辨率的光學(xué)掃描。可以通過調(diào)整激光束和檢測平面的位置，獲取不同深度的光學(xué)切片，最后將這些切片組合起來，形成整個組織的三維重建圖像，讓我們能夠詳細地觀察到樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的空間組織。

隨著研究的深入，各種各樣的組織透明化方案不斷涌現(xiàn)。這些方案雖然使用的化學(xué)物質(zhì)不同，但基本原理是相似的，都包括組織固定、脫鈣（如果樣本包含骨頭）、脫色（去除內(nèi)源性色素）、脫脂（去除脂質(zhì)）以及折射率匹配（讓樣本和成像介質(zhì)的折射率一致，以達到最大透明度）等步驟。

iPEGASOS技術(shù)的誕生
盡管組織透明化技術(shù)取得了很大進展，但目前大多數(shù)透明化方案在與免疫標(biāo)記技術(shù)結(jié)合時還存在問題。熒光報告基因常被用于可視化感興趣的分子，然而在透明化過程中，基于基因靶向方法的熒光信號強度通常會降低。有時候，即使使用轉(zhuǎn)基因和病毒輔助基因遞送，熒光信號在透明化后也可能變得非常微弱，甚至無法與背景噪聲區(qū)分開來。而且，抗體很難穿透到整個大腦這樣的大組織的深層，限制了全腦標(biāo)記。

為了解決這些問題，從兩種成熟的方案——iDISCO染色和PEGASOS透明化中汲取靈感，開發(fā)出了iPEGASOS技術(shù)。不僅能讓組織具有出色的透明度，還能在長達一年的時間里保持強大的熒光信號，并且能夠讓抗體深入穿透大型組織，包括整個小鼠大腦。

iPEGASOS技術(shù)的實驗過程
實驗動物準備
在實驗中，研究人員使用了多種成年小鼠。這些小鼠就像是不同的“研究模型”，每一種都有其獨特的特點，為研究提供了多樣化的視角。

iPEGASOS溶液制備：
脫色溶液用于去除樣本中的色素；脫脂溶液能有效去除脂質(zhì)；染色預(yù)處理溶液、通透溶液、封閉溶液、染色溶液等則在免疫染色過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，幫助抗體更好地與目標(biāo)結(jié)合；脫水溶液和透明介質(zhì)則用于脫水和提高樣本透明度，讓大腦樣本變得更加“清澈”。

iPEGASOS被動浸泡程序：
固定后的腦組織要先清洗，然后依次浸泡在脫色溶液、脫脂溶液、通透溶液、封閉溶液、染色溶液中進行免疫染色，之后還要進行第二輪脫脂、脫水和透明化處理，最后才能進行成像。而且，不同大小的樣本在各個步驟中的孵育時間也有所不同，都需要精確控制。

從大腦的背側(cè)到腹側(cè)，在不同深度的光學(xué)切片中都能觀察到豐富而強烈的信號，即使在光學(xué)像差最嚴重的腹側(cè)部分，也能實現(xiàn)單細胞分辨率成像。通過對這些信號的分析和三維重建，我們能夠清晰地看到VIP神經(jīng)元細胞體及其相關(guān)過程，包括樹突的結(jié)構(gòu)。

實現(xiàn)完整小鼠大腦的神經(jīng)回路映射
為了深入了解大腦的神經(jīng)回路，研究人員使用病毒示蹤劑來標(biāo)記神經(jīng)回路。iPEGASOS技術(shù)在為注射了病毒示蹤劑的大腦提供了出色的信噪比，讓神經(jīng)元和神經(jīng)過程都能清晰成像。在這個過程中，不僅能夠觀察到起始細胞和單突觸輸入細胞的位置，還能清晰地看到軸突束和單個軸突的形態(tài)，甚至能夠追蹤單個軸突丘腦路徑，這對于理解神經(jīng)回路的連接和功能具有重要意義。

追蹤阿爾茨海默病小鼠模型中β-淀粉樣蛋白的積累
研究人員使用iPEGASOS技術(shù)對小鼠模型進行研究，這是一種快速發(fā)展出明顯淀粉樣病理的小鼠模型。通過對不同年齡的小鼠大腦進行免疫染色，使用抗體來檢測β-淀粉樣蛋白的沉積，該技術(shù)能夠清晰地捕捉到β-淀粉樣蛋白斑塊在大腦中的分布和隨年齡的變化。從6個月大開始，β-淀粉樣蛋白斑塊就已經(jīng)出現(xiàn)在整個皮層，隨著年齡的增長，斑塊逐漸積累并擴散到其他腦區(qū)。而且，通過對信號強度和斑塊面積的量化分析，進一步證實了該技術(shù)在追蹤β-淀粉樣蛋白積累方面的有效性，為研究阿爾茨海默病的發(fā)病機制和治療提供了重要的工具。

iPEGASOS技術(shù)的優(yōu)勢突破
保留熒光信號能力強
在小鼠腦切片實驗中，iPEGASOS處理的樣本不僅保留了可見的內(nèi)源性GFP信號，免疫染色信號強度也更高。這表明iPEGASOS能更好地利用樣本已有的熒光信號，同時增強免疫染色效果。

成本效益和抗體兼容性好
與其他免疫染色策略相比，iPEGASOS采用增強樣本通透性的方法，使用常見且廉價的試劑，與標(biāo)準的兩步間接熒光免疫染色過程兼容。這使其在成本效益和抗體兼容性方面優(yōu)勢明顯，且無需特殊實驗設(shè)備，降低了實驗門檻。

成像及樣本保存優(yōu)勢突出
與基于2D切片的3D重建技術(shù)相比，iPEGASOS結(jié)合光片顯微鏡成像，具有成像時間短、可多次成像、樣本保存時間長等優(yōu)點。雖然PEGASOS存在組織收縮問題，但iPEGASOS在一定程度上進行了改善，并且能夠?qū)�厚組織進行免疫染色，這是許多2D切片技術(shù)無法實現(xiàn)的。

實驗總結(jié)與展望
盡管iPEGASOS技術(shù)已經(jīng)取得了很大的成功，但仍然有一些問題需要進一步研究。比如，在成像配置方面，雖然研究人員通過實驗證明了成像視角對信號強度的影響不大，但對于一些需要精確比較全腦區(qū)域信號強度的研究，還需要探索更好的成像策略，以減少潛在的偏差。此外，隨著神經(jīng)科學(xué)研究的不斷深入，對于大腦結(jié)構(gòu)和功能的研究要求也越來越高。未來，iPEGASOS技術(shù)可能會與其他先進技術(shù)相結(jié)合，進一步提高成像分辨率和對復(fù)雜神經(jīng)回路的解析能力。同時，在研究神經(jīng)退行性疾病等方面，iPEGASOS技術(shù)也有望為藥物研發(fā)和治療方案的制定提供更有力的支持。通過這項技術(shù)，我們能夠更清晰地觀察大腦的結(jié)構(gòu)和功能，深入了解神經(jīng)回路的奧秘，為神經(jīng)科學(xué)研究和相關(guān)疾病的治療帶來了新的希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。
Gao P, Rivera M, Lin X, Holmes TC, Zhao H, Xu X. Immunolabeling-compatible PEGASOS tissue clearing for high-resolution whole mouse brain imaging. Front Neural Circuits. 2024 Apr 17;18:1345692.
DOI: 10.3389/fncir.2024.1345692.