多光子成像在生物醫(yī)學特別是腦科學研究中應(yīng)用廣泛，為深層生物組織結(jié)構(gòu)及動力學研究提供了非侵入性和非破壞性的成像手段。生物組織的吸收和強散射特性限制了成像深度。近年來，得益于原理及技術(shù)上的進步，多光子成像在活體生物中的成像深度顯著提高。其中，1700nm波段激發(fā)的多光子成像顯著降低組織吸收及散射，與其他激發(fā)波段相比獲得了目前最大的成像深度。

多光子成像技術(shù)背景研究
技術(shù)的誕生與發(fā)展
自20世紀90年代康奈爾大學Denk等首次成功演示雙光子激光掃描顯微成像技術(shù)，多光子成像技術(shù)便在生命科學領(lǐng)域嶄露頭角。這項技術(shù)以其深層穿透（毫米量級）、非侵入式且無損、高空間分辨率（亞微米量級）以及強大的功能成像和動力學追蹤能力，迅速在眾多生命科學研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。從復雜神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的描繪，到疾病的精準診斷；從神經(jīng)細胞功能的深入探究，到血流變化的精確測量，多光子成像技術(shù)為科研工作者提供了前所未有的研究視角。

隨著研究的不斷深入，科研人員對多光子成像技術(shù)提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大視場、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技術(shù)不斷演進，逐漸形成了超分辨成像、大視場成像、高速成像和深層成像等多個發(fā)展方向。這些發(fā)展方向相互交織，共同推動著多光子成像技術(shù)向更高水平邁進。

深層成像面臨的挑戰(zhàn)
在多光子成像技術(shù)的發(fā)展歷程中，深層成像一直是備受關(guān)注的重點領(lǐng)域。然而，生物組織的復雜特性卻為深層成像帶來了巨大的挑戰(zhàn)。生物組織的結(jié)構(gòu)極不均勻，這使得激發(fā)光在其中傳播時會發(fā)生強烈的散射。同時，生物組織對激發(fā)光的吸收現(xiàn)象也較為顯著，對于絕大多數(shù)組織而言，主要是水吸收。這兩種因素疊加在一起，導致激發(fā)光功率隨著成像深度的增加而呈指數(shù)衰減。

以活體動物腦成像為例，常用的鈦寶石激光器在775nm波長激發(fā)時，活體小鼠腦血管的雙光子熒光成像深度僅能達到腦表面下650μm，這一深度在解剖學上僅對應(yīng)于灰質(zhì)層。若要深入研究腦部的白質(zhì)層和海馬體等更深層結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)的成像技術(shù)就顯得力不從心。為了突破這一限制，科研人員嘗試了插入光學探針、使用顯微內(nèi)窺鏡或者移除大腦灰質(zhì)層等方法，但這些方法都違背了多光子成像無損、非侵入的優(yōu)點。

第二種策略：是采用更高階非線性激發(fā)，如三光子成像。這種成像方式能夠進一步抑制表面背景信號，顯著提高深層的信號背景比。利用1665nm激發(fā)三光子熒光，科研人員實現(xiàn)了腦表面下2100μm的深層腦血管成像，這也是目前最深的多光子腦成像。而且，深層信號背景比達到46，顯示出三光子成像在深層成像方面的巨大潛力。

在眾多長波長激發(fā)波段中，1700nm波段憑借其獨特的優(yōu)勢脫穎而出，成為了科研人員關(guān)注的焦點。它在降低組織吸收和散射方面表現(xiàn)優(yōu)異，具有較大的有效衰減長度，理論上能夠?qū)崿F(xiàn)比其他波段更深的成像深度，為深層生物組織成像帶來了新的希望。

1700nm波段多光子成像的原理剖析
多光子顯微成像的神奇原理
1700nm波段多光子成像技術(shù)的基礎(chǔ)是多光子顯微成像原理，這一原理基于非線性光學效應(yīng)，展現(xiàn)出令人驚嘆的微觀成像能力。單光子熒光和多光子熒光在產(chǎn)生機制上有著顯著的區(qū)別。單光子熒光在整個激發(fā)光通路上都會產(chǎn)生；而多光子熒光則多個激發(fā)光子與物質(zhì)相互作用，這種非線性的相互作用使得只有在焦點處才會產(chǎn)生顯著的熒光信號。

這種特性賦予了多光子顯微成像獨特的優(yōu)勢。它不僅具有本征的三維成像能力，能夠在三維空間中精準定位目標，還具備亞微米量級的高分辨率，能夠清晰分辨微觀結(jié)構(gòu)，以及毫米量級的成像深度，可深入生物組織內(nèi)部進行觀測。多光子顯微成像利用近紅外波段激發(fā)，巧妙地減少了組織散射的影響，大大降低了激發(fā)光在傳輸過程中的損耗，使其能夠?qū)崿F(xiàn)深層生物組織成像。

1700nm波段多光子成像的應(yīng)用場景
活體小鼠深層腦血管成像
腦血管成像在深層腦成像中占據(jù)著重要地位，大腦中的血管為神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，同時清除代謝產(chǎn)物，對維持大腦正常功能起著關(guān)鍵作用。2013年，康奈爾大學Xu團隊利用棒狀光纖孤子自頻移獲得的1675nm孤子光源，首次實現(xiàn)了活體小鼠白質(zhì)層的三次諧波成像（無標記）和海馬體三光子熒光血管成像，成像深度達到1340μm，開啟了1700nm波段多光子成像在腦血管成像領(lǐng)域的探索之旅。此后，科研人員不斷優(yōu)化飛秒脈沖孤子光源，提升成像深度和效果，實現(xiàn)了活體小鼠腦表面下2100μm的深層血管成像，這也是目前1700nm波段激發(fā)活體動物三光子熒光成像的最大成像深度，相比最初的成像深度有了顯著提升。

1700nm波段激發(fā)不僅在三光子成像中表現(xiàn)出色，在雙光子成像方面也有出色表現(xiàn)。此外，科研人員還發(fā)現(xiàn)1700nm波段雙光子熒光血管成像已接近理論極限，而三光子熒光血管成像仍有很大的發(fā)展空間。

髓鞘是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，手指皮膚結(jié)構(gòu)異常與神經(jīng)病變密切相關(guān)。He等人利用1700nm波段三光子熒光成像，結(jié)合特異性熒光染料標記手指皮膚髓鞘，實現(xiàn)了皮膚表面下340μm髓鞘成像。此外，由于外源性熒光標記物存在毒性和光漂白問題，無標記三次諧波成像在皮膚成像中愈發(fā)重要。髓鞘富含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，能產(chǎn)生強三次諧波信號，利用1700nm波段三光子成像研究小鼠趾部皮膚髓鞘結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無標記三次諧波成像與三光子熒光成像共定位，可實現(xiàn)皮膚深層髓鞘成像，且具有無標記和不受光漂白影響的優(yōu)勢。

總結(jié)與展望
盡管1700nm波段多光子成像技術(shù)已取得顯著進展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前，該波段激發(fā)三光子熒光成像的成像深度受激發(fā)光源和熒光標記物的限制，僅能達到2100μm。在腦細胞成像和腦細胞動力學研究方面，該技術(shù)也存在局限性。結(jié)合自適應(yīng)光學技術(shù)，通過矯正生物組織導致的光波波前畸變，有望進一步提升活體生物成像深度和分辨率。開發(fā)近紅外波段的高亮度熒光探針也是關(guān)鍵方向之一。近紅外熒光探針具有光損傷小、深層組織穿透能力強、對生物樣品中生物分子背景自發(fā)熒光干擾小等優(yōu)點，有利于實現(xiàn)更深層的組織成像。

DOI：10.3788/LOP232274