正交供體-受體小分子染料構建兩性離子晶狀納米聚集體實現(xiàn)協(xié)同光療
本文要點：開發(fā)小分子染料聚集的納米光敏劑（nanoPS）用于協(xié)同光療，是精準醫(yī)學中引人注目的前沿研究。但目前，對分子結構、組裝行為和治療功能之間相互作用的研究有限。在這里，引入了“晶體聚集體中的自旋軌道電荷轉移系間躍遷（SOCT-ISC）”的概念，能夠顯著增強小分子nanoPS的光動力（PD）和光熱（PT）特性。具體而言，在含有三氰基呋喃（TCF）陰離子七甲川青（TCF-Cy7-TCF）染料的中位位置引入了一個陽離子吡啶（Py）基團，以構建一個正交電荷轉移二聯(lián)體（TCF-Cy7(Py)-TCF），通過SOCT-ISC機制增強三重態(tài)的形成以增強PD特性。雙性離子基團賦予TCF-Cy7(Py)-TCF即使在超低濃度下也具有高結晶度，決定了其在聚集體中的堆積行為，并增強了PT和PD特性。與TCF-Cy7-TCF相比，TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體表現(xiàn)出更高的單線態(tài)氧量子產率（0.8% vs 0.2%）和光熱轉換效率（55.06% vs 7.78%）。令人印象深刻的是，TCF-Cy7(Py)-TCF優(yōu)先積聚在腫瘤部位，在NIR-I和NIR-II窗口中實現(xiàn)了高信噪比的腫瘤成像，并且非特異性結合極少。最終，體內實驗證實TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體作為協(xié)同光療的nanoPS功能，為設計單組分PS用于臨床轉化提供了一種簡單而有效的策略。
研究者提出了一種利用“晶體納米聚集體中的SOCT-ISC”的方法，將SOCT-ISC的優(yōu)勢與PS的超分子組裝結合到一個統(tǒng)一的納米平臺中。在本研究中，通過將吡啶陽離子（Py）引入到對稱陰離子Cy7（TCF-Cy7-TCF）的中位位置構建了一個雙性離子二聯(lián)體（TCF-Cy7(Py)-TCF）。這個二聯(lián)體可以在水溶液中以極低的濃度自組裝成納米聚集體，而不需要穩(wěn)定劑和賦形劑（圖1）。通過這種設計，由于PS的正交幾何結構的自組裝限制了輻射衰減，TCF-Cy7(Py)-TCF的光熱轉換效率和ROS生成顯著優(yōu)于市售的ICG以及類似的TCF-Cy7-TCF。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF在聚集體中松散堆積，這可以優(yōu)化非輻射衰減，并有助于增強PTT和PDT性能。具有雙性離子性質的TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體通過增強了的滲透和滯留（EPR）效應表現(xiàn)出超低的非特異性組織攝取和高腫瘤積累。使用皮下腫瘤小鼠模型證實，TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體不僅提供精確的光聲（PA）和近紅外（NIR）熒光成像，還通過“晶體納米聚集體中的SOCT-ISC”機制表現(xiàn)出PTT/PDT協(xié)同效應，為設計先進的光治療劑提供了新的分子指導。
圖2. TCF-Cy7（Py）-TCF及其母體分子TCF-Cy7-TCF的光物理性質。
TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的穩(wěn)態(tài)紫外-可見-近紅外（UV-Vis-NIR）吸收光譜進行了研究（圖2）。在有機溶劑如甲醇（MeOH）中，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的吸收（圖2a,b）和熒光（圖2c）光譜與相關的TCF-Cy7-TCF染料非常相似。具體而言，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體在甲醇中的吸收光譜在904 nm處顯示出一個強烈的峰值，相比于TCF-Cy7-TCF（888 nm）發(fā)生了紅移（圖2b）。此外，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的熒光光譜也相應地紅移（圖2c），但其Stokes位移保持不變。對于TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的主要發(fā)色團，獲得了類似的ESP分布，負區(qū)域出現(xiàn)在兩側的TCF基團中，而正區(qū)域集中在Cy7的多亞甲基橋中，表明它們具有高度對稱的電子結構（圖2d）。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體的Py基團上出現(xiàn)了一個極度正的區(qū)域，表明Py基團具有強烈的電子吸引特性（圖2d）。為了進一步可視化電荷轉移動力學，進行了飛秒瞬態(tài)吸收（fs-TA）測量（圖2f，g）。在780 nm的脈沖激光激發(fā)下，水中的TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體均在其最大吸收處顯示出明顯的負吸收帶，這被歸因于基態(tài)漂白（GSB）。對于TCF-Cy7-TCF（40 µm），在≈570 nm處觀察到激發(fā)態(tài)吸收（ESA）帶（圖2f），這歸因于1TCF-Cy7-TCF態(tài)，其完全衰減時間僅為≈96 ps（圖2h）。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF二聯(lián)體（40 µm）在1.11 ps內在≈600 nm處呈現(xiàn)出一個特別顯著的峰值，這可以歸因于CTS（TCF-Cy7-TCF–Py+−，圖2g）。其衰減動力學在納秒時間尺度上（>3 ns）未顯示出完全恢復，這表明具有慢電荷重組的長壽命CTS可以優(yōu)先松弛到激發(fā)的T1態(tài)（圖2h）。
圖3. TCF-Cy7（Py）-TCF 在水溶液中的自組裝和光療性能
使用動態(tài)光散射（DLS）對水中的明顯聚集體進行表征，發(fā)現(xiàn)TCF-Cy7-TCF僅表現(xiàn)出有限的聚集，未形成納米聚集體。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF形成了平均水動力直徑約為155 nm的納米聚集體。這樣的納米聚集體非常穩(wěn)定，在水或補充血清的細胞培養(yǎng)基中孵育24小時后不會沉淀或形成大塊（圖3a）。透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示TCF-Cy7(Py)-TCF納米聚集體的形態(tài)為規(guī)則的球形納米粒子，平均大小約為140 nm（圖3b）。使用高倍TEM進一步研究了納米粒子中TCF-Cy7(Py)-TCF分子的堆積模式，顯示存在一些小的超分子晶體域（圖3c）。TCF-Cy7(Py)-TCF納米粒子的粉末X射線衍射圖譜顯示了與其單晶相似的圖譜，表明TCF-Cy7(Py)-TCF分子的排列方式類似于其單晶中的排列（圖3d）。此外，原子力顯微鏡（AFM）顯示納米粒子具有清晰的圓形邊緣，其厚度/直徑比遠小于1，表明其結構類似于二維結構的納米碟（圖3e）。值得注意的是，TCF-Cy7(Py)-TCF能夠在低至35 nm的濃度下形成這樣的納米碟，這種超低臨界膠束濃度（CMC）表明納米碟在臨床相關濃度下可能比商業(yè)膠束更穩(wěn)定。
接著研究了TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在激光照射下產生高熱或ROS的能力。在近紅外（NIR）照射下（808 nm, 1.0 W cm−2）10分鐘，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的溶液溫度分別在10、20和40 µm的濃度下增加到47.6、54.0和59.5 °C（圖3f）。TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的光熱轉換效率（η）值為55.06%，顯著高于TCF-Cy7-TCF（7.78%）（圖3g）。TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的產熱能力在連續(xù)五次輻照-冷卻循環(huán)后保持一致（圖3h），表明其光熱穩(wěn)定性優(yōu)于TCF-Cy7-TCF。如圖3i所示，DPBF在NIR照射（808 nm，0.3 W cm−2）下迅速降低吸收，表明TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟產生了ROS，而單獨的DPBF在相同照射5分鐘內保持穩(wěn)定（圖3j）。然后確定DPBF的分解速率常數(shù)（圖3k），計算出TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在水中的Φ∆為0.8%，是ICG的四倍。同時，在水中具有有限聚集但缺乏正交Py的TCF-Cy7-TCF的Φ∆測量值為0.21%，略高于相同條件下的ICG。使用 “聚集體中的SOCT-ISC”機制，該機制將SOCT-ISC的益處與PS的超分子組裝集成到一個平臺中，實現(xiàn)高效的PTT/PDT。
圖4a中的黃色熒光表明TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟與溶酶體的共定位，得到的Pearson相關系數(shù)（Rr）約為92%。相比之下，4T1細胞中TCF-Cy7-TCF和LysoTracker Green的Rr僅為73%，表明TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟和TCF-Cy7-TCF通過不同的途徑被細胞內化。這些發(fā)現(xiàn)進一步表明TCF-Cy7-TCF表現(xiàn)出有限的聚集，并且不形成大尺寸的納米粒子。
通過商業(yè)試劑確定細胞中由照射介導的ROS生成。在近紅外（NIR）照射（808 nm, 0.3 W cm−2）下，使用TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟處理的4T1細胞產生強烈的細胞內綠色熒光，這種熒光增強被ROS清除劑維生素C（Vc）顯著抑制。相比之下，在用TCF-Cy7-TCF或PBS處理的對照組中，無論是否激光照射，均未檢測到明顯的熒光信號（圖4b）。結果表明，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在NIR照射下具有在細胞中生成ROS的強大能力，使其非常適合用于PDT。
為了驗證增強的PDT和PTT的協(xié)同效應，使用等濃度的TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟或TCF-Cy7-TCF（12.5 µm）處理4T1細胞，進行LIVE/DEAD染色試驗。結果顯示，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在單模式（單一PTT或PDT）和協(xié)同光療（圖4c）中均表現(xiàn)出優(yōu)于TCF-Cy7-TCF的效果，同時具有良好的生物相容性（圖4d）。隨后，計算了在NIR照射下細胞的半數(shù)最大抑制濃度（IC50），得出了TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟在單一PDT、單一PTT和PDT與PTT結合中的IC50值分別為16.8、5.6和5.0 µM（圖4d）。相比之下，在4T1細胞中，TCF-Cy7-TCF在單一PTT和PDT/PTT結合中的IC50值分別為29.6和25.4 µM。這些結果表明，TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟介導的PTT和PDT結合作為一種有前途的策略，可以在空間和時間可控的方式中，以高生物安全性有效消除癌細胞。
在牛血清白蛋白（BSA）溶液中使用TCF-Cy7(Py)-TCF納米碟的吸收和熒光光譜評估TCF-Cy7(Py)-TCF的非特異性結合，陰離子TCF-Cy7-TCF作為對照（圖5a，b）。在含有BSA的水溶液中，TCF-Cy7-TCF恢復了其在有機溶劑中的特征吸收，并在≈950 nm處顯示出強烈的熒光，表明TCF-Cy7-TCF通過與BSA結合從寡聚體轉變?yōu)閱误w。相比之下，TCF-Cy7(Py)-TCF在BSA溶液中的吸收和熒光光譜未顯示顯著變化，這表明它與BSA沒有顯著的相互作用。進一步進行分子對接研究，通過使用優(yōu)化構象評估TCF-Cy7-TCF和TCF-Cy7(Py)-TCF與BSA的相互作用。TCF-Cy7-TCF與BSA的結合能為−9.86 kcal mol−1，而TCF-Cy7(Py)-TCF與BSA的結合能僅為−5.81 kcal mol−1，表明由于其雙性離子和親水性性質，TCF-Cy7(Py)-TCF與BSA結合口袋的結合要比陰離子TCF-Cy7-TCF弱得多（圖5c）。
由TCF-Cy7（Py）-TCF納米微�；騎CF-Cy7-TCF的光熱轉換引起的熱彈性膨脹產生了光聲（PA）信號，該信號被用作非侵入性PA成像的造影劑。如圖5d，e所示，腫瘤部位TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的PA信號在1-8小時內迅速增加，并且顯著高于腫瘤中TCF-Cy7-TCF的PA信號，這可能是由于TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的光-熱轉換較高。應該強調的是，用TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒處理的小鼠的初始PA背景遠低于TCF-Cy7-TCF，并且在24小時后幾乎可以忽略不計，這可能是由于快速清除和低非特異性攝取TCF-Cy7（Py）-TCF。相反，TCF-Cy7-TCF在同一時間過程中幾乎沒有背景降低，表明在正常組織和器官中有顯著的非特異性攝�。▓D5d）。
之后研究者測量了TCF-Cy7（Py）-TCF納米AUCER或TCF-Cy7-TCF在小鼠4T1腫瘤模型中的體內性能。注射后8小時，小鼠接受剖腹手術，僅在腫瘤（信號背景比，SBR:2.57±0.56）和腸道（SBR:1.65±0.56）中觀察到NIR窗口I（NIR-I，700-900 nm）中TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的熒光，而TCF-Cy7-TCF主要在肝臟（SBR:2.47±0.10）和腸道（SBR:5.02±0.26）等代謝器官中表現(xiàn)出高NIR-I信號，證實TCF-Cy7（Py）-TCF納米微�？梢遭g化Ely通過EPR效應在腫瘤部位累積（圖5f）。值得注意的是，在含白蛋白的環(huán)境中，TCF-Cy7-TCF的熒光峰紅移至943 nm，而TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的最大發(fā)射保持在980 nm（圖5b），兩者均顯示第二個NIR窗口（NIR-II，1000-1700 nm）的尾部熒光，由于穿透深度更深，分辨率更高，自發(fā)熒光為零，可用于避免剖腹手術和開胸手術。注射后6-8小時，通過用NIR-II PL體內成像系統(tǒng)（系列III 900/1700）繪制NIR-II熒光強度圖，TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒的信號在腫瘤（SBR:7.95±0.11）和肝臟（SBR:6.08±1.56）中積累，對比度良好（圖5g）。為了比較，系統(tǒng)地觀察到TCF-Cy7-TCF的NIR-II信號，在沒有腫瘤靶向的正常組織和器官中顯示出顯著的非特異性攝取。剖腹手術后的影像學結果非常相似（圖5g）�？傮w而言，兩性離子TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒通過電荷/疏水性屏蔽最小化了與血清白蛋白的相互作用，并在腫瘤部位累積，減少了正常組織和器官中的非特異性攝取，從而產生足夠高的腫瘤背景比成像。
在多模式成像的指導下，研究者使用TCF-Cy7-TCF作為對照，進一步評估了TCF-Cy7（Py）-TCF納米微粒對攜帶4T1癌癥的皮下腫瘤異種移植小鼠的光療功效。將35只小鼠隨機分為7組，用紅外熱成像監(jiān)測腫瘤表面的實時溫度（圖6a）。照射后10分鐘內，“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組小鼠的腫瘤表面溫度超過50°C，而“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.15 W cm-2”，“TCF-Cy7-TCF+0.5 W cm-2”和“鹽水+0.5 W cm-2”組小鼠的腫瘤表面溫度僅分別增加至41、42和34°C（圖6b）。每組腫瘤大小每2天監(jiān)測一次，持續(xù)16天（圖6c，d）。對照組小鼠的腫瘤大小持續(xù)增加，與第1天相比，在第16天經(jīng)歷了約13倍的擴張，這些組之間的腫瘤體積沒有顯著差異（圖6d）。“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組小鼠的腫瘤被有效消融，導致腫瘤部位出現(xiàn)燒傷疤痕，這在對照組中未觀察到（圖6c）。到第11天，用TCF-Cy7（Py）-TCF進行協(xié)同光療的小鼠的瘢痕已經(jīng)愈合，并且在很長一段時間內沒有觀察到腫瘤復發(fā)，直到安樂死之前也沒有任何死亡率。通過蘇木精和曙紅（H＆E）以及不同組腫瘤的TUNEL染色也證實了體內腫瘤光療的效果。H＆E染色清楚地顯示“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組中的腫瘤具有大量壞死區(qū)域，TUNEL染色顯示細胞凋亡在腫瘤中最有效“TCF-Cy7（Py）-TCF+0.5 W cm-2”組（圖6e）。
總之，本文提出了“聚集體中的SOCT-ISC”的概念，以增強基于小分子的PS的PDT和PTT性能，旨在協(xié)同光療腫瘤�；谶@一概念，通過在陰離子TCF-Cy7-TCF的中間位置摻入陽離子Py基團來設計小分子PS，從而形成正交的二元TCF-Cy7（Py）-TCF。這種二元自組裝成納米聚集體，與母體分子TCF-Cy7-TCF相比，ROS產生（0.8%）和光熱轉換效率（55.06%）顯著增強。值得注意的是，TCF-Cy7（Py）-TCF的兩性離子性質賦予納米聚集體以優(yōu)異的穩(wěn)定性，即使在超低濃度下也是如此，并且賦予它們低的非特異性結合，導致正常組織和器官中的攝取最小，并且腫瘤中的高積累用于多模式成像。最后，TCF-Cy7（Py）-TCF納米聚集體在體外和體內均具有優(yōu)異的抗腫瘤功效，并具有高生物相容性。這種獨特的超分子策略可能為設計用于抗腫瘤治療中協(xié)同PTT/PDT的高性能小分子PS提供有價值的見解，顯示出未來臨床實施的巨大潛力。
參考文獻
Hao X, Gao M, Zhang R, et al. Synergistic Phototherapy Using Zwitterionic Crystalline Nanoaggregates of Orthogonal Donor–Acceptor Small‐Molecule Dyads[J]. Advanced Functional Materials, 2024: 2416317.
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