“細胞外囊泡”(EVs)是細胞自然釋放的細胞衍生顆粒與磷脂雙分子層。EVs存在于體液中,如血液和尿液。EVs的特性,如細胞起源、濃度、組成和功能是疾病依賴性的。因此,人們正在探索EVs作為疾病的生物標志物,包括癌癥和心血管疾病。然而,為了將EVs作為生物標志物,需要可靠和可重復的EVs測量方法。目前,EVs生物標志物研究的主要障礙是儀器和不同單位之間測量結(jié)果的不可比性,這阻礙了多中心研究的建立。多中心研究是臨床生物標志物研究的先決條件。
為了提高數(shù)據(jù)的可比性,本研究開發(fā)具了有類似EVs物理性質(zhì)的新參考材料和參考程序。新參考材料和參考程序的驗證需要生物測試樣品。我們開發(fā)了一種人血漿EVs測試樣品(PEVTES),它i)類似于血漿中的亞細胞顆粒,ii)是現(xiàn)成的,iii)與流式細胞儀兼容,iv)是穩(wěn)定的。方法:采用3例空腹供體血漿制備PEVTES。用血小板特異性(CD61)和紅細胞特異性(CD235a)抗原或乳黏附素抗體對EVs進行免疫熒光染色。為了降低可溶性蛋白、脂蛋白和未結(jié)合試劑的濃度,通過大小排斥層析從血漿中分離染色的EVs。分離后,過濾PEVTES以去除殘余血小板。PEVTESs用冷凍保存劑、二甲亞砜(DMSO)、甘油或海藻糖稀釋,在- 80℃保存12個月。解凍后,用校準的納米流式細胞儀(Apogee A60-Micro)測量染色的EV濃度。
為了評估PEVTES穩(wěn)定性,在冷凍前和- 80◦c條件下保存1、3、6和12個月后,用流式細胞儀測量染色的EVs濃度,并對其流速、熒光信號和光散射信號進行校準。制備PEVTES的不同步驟的示意圖概述。步驟包括人血漿的收集和制備,染色程序,尺寸排除層析,用0.8 μm 孔徑大小的聚碳酸酯過濾器去除殘留的血小板,并通過添加不同的冷凍保存保存PEVTES(圖1)。
圖1.制備血漿細胞外囊泡(EV)檢測樣品(PEVTES)的實驗流程。
用校正納米流式細胞儀(Apogee A60-Micro, Apogee flow Systems)測量(A)染色的人血漿和(B)儲存在(B)二甲亞砜(DMSO)、(C)甘油或(D)海藻糖中的凍融血漿EV測試樣品(PEVTES)的等效可溶性熒光色素(MESF)的直徑(nm)與熒光強度(異體藻藍蛋白(APC)分子)。紅色門表示免疫熒光染色(血小板來源)的EVs群體,可以根據(jù)散射信號從背景中區(qū)分出來(圖2)。
圖2. 流式細胞儀測量凍融血漿EV測試樣品(PEVTES)
與不涉及凍融循環(huán)的新鮮起始材料相比,在DMSO中保存12個月的CD61+ EVs的測量濃度下降了33%,在甘油中保存增加了9%,在海藻油中保存增加了6%,圖3A-C。為CD235a+ EVs的濃度圖3D-F所示的CD235a+ EV在DMSO、甘油和海藻糖中的濃度分別比新鮮起始材料降低約70%、23%和15%。圖3G-I所示,乳酸粘附素+EV的濃度在DMSO中分別下降23%,甘油中下降28%,海藻糖中下降19%(圖3)。
圖3. 血漿EV測試樣品(PEVTES)貯存期間的穩(wěn)定性檢測
結(jié)論
PEVTES 1)類似于血漿中的亞細胞顆粒,2)易于使用,3)與納米流式細胞術(shù)兼容,4)穩(wěn)定性好。因此,開發(fā)的PEVTES是驗證新開發(fā)的參考物和程序的理想候選物。
原文:Plasma extracellular vesicle test sample to standardize flowcytometry measurements
英國Apogee超靈敏納米流式分析儀,專為外泌體微囊泡(EVs)等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計,在EVs樣品顆粒大小分析,絕對定量,多標記物同時快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前,該設(shè)備已累計參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實驗分析工作。其出色的靈敏度,穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認可,并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅實支持。
Apogee納米流式除了可用于納米級別的顆粒 (如:細胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP) 等,還可以用于作常規(guī)動物細胞檢測 (如免疫細胞、哺乳類動物細胞、等)。它是一臺全面且功能強大的納米流式分析儀!
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