骨和牙組織一直以來(lái)都是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。從功能上看，它們承擔(dān)著不可或缺的角色。骨骼為身體提供支撐框架，保障我們能夠站立、行走和進(jìn)行各種活動(dòng)；牙齒則負(fù)責(zé)咀嚼食物，開啟消化過(guò)程的第一步。長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到感覺(jué)和交感神經(jīng)元對(duì)骨和牙組織有著緊密的神經(jīng)支配關(guān)系。例如，在疼痛感知方面，當(dāng)我們的牙齒出現(xiàn)齲齒或骨骼受到損傷時(shí)，會(huì)產(chǎn)生疼痛信號(hào)，這背后就離不開神經(jīng)的傳導(dǎo)。在骨穩(wěn)態(tài)的維持上，神經(jīng)也發(fā)揮著微妙的調(diào)節(jié)作用，它們就像幕后的“指揮官”，協(xié)調(diào)著骨細(xì)胞的活動(dòng)，確保骨骼的正常代謝和修復(fù)。

過(guò)往的研究主要依賴傳統(tǒng)的組織學(xué)分析方法，也就是對(duì)薄切片進(jìn)行研究。這種方法雖然在一定程度上為我們提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)，但存在著明顯的局限性。當(dāng)試圖從多個(gè)薄切片重建三維圖像時(shí)，由于在切片過(guò)程中重要結(jié)構(gòu)信息的丟失或扭曲，我們很難全面、準(zhǔn)確地觀察和分析分散的神經(jīng)元投射情況。而且，三維重建過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)，還容易因?yàn)榍衅�間染色的差異和人為因素引入誤差，就像拼圖時(shí)部分拼圖塊缺失或錯(cuò)誤，難以還原完整的圖像。

隨著科技的飛速發(fā)展，組織透明技術(shù)和光片三維成像技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，為這一研究領(lǐng)域帶來(lái)了新的曙光。這些先進(jìn)技術(shù)使得在完整組織中以細(xì)胞分辨率對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維可視化研究成為可能。

研究方法精要
1、組織取材和脫鈣
研究選取小鼠其股骨和下頜骨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先是組織取材與固定，小鼠經(jīng)麻醉后，通過(guò)左心室灌注特定溶液，取出股骨和下頜骨，仔細(xì)清理周圍軟組織，并在特定條件下進(jìn)行固定。接著是關(guān)鍵的脫鈣環(huán)節(jié)，在室溫下進(jìn)行30-40小時(shí)的脫鈣處理，同時(shí)不斷旋轉(zhuǎn)樣本，確保脫鈣效果均勻。

2、組織脫色、染色和透明
脫鈣完成后進(jìn)行脫色、免疫染色等操作，其中免疫染色使用了抗體，每種抗體的稀釋比例和孵育條件都經(jīng)過(guò)了精心優(yōu)化。最后進(jìn)行組織透明化處理，通過(guò)一系列試劑的梯度浸泡和孵育，使組織達(dá)到透明狀態(tài)，便于后續(xù)成像觀察。

3、圖像處理
在成像方面，綜合運(yùn)用立體顯微鏡和光片熒光顯微鏡，針對(duì)不同的樣本和觀察需求，選擇合適的物鏡和成像參數(shù)，確保能夠獲取高質(zhì)量的圖像。隨后利用專業(yè)軟件對(duì)圖像進(jìn)行處理和分析，包括圖像預(yù)處理、拼接和三維可視化和神經(jīng)元分割等操作，從而清晰地呈現(xiàn)神經(jīng)末梢在骨和牙組織中的空間三維分布情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果亮點(diǎn)
1、股骨神經(jīng)纖維分布
在股骨的研究中，發(fā)現(xiàn)GP9.5標(biāo)記的神經(jīng)束有著獨(dú)特的分布路徑。它們通過(guò)股骨近端干骺端和遠(yuǎn)端骨骺的滋養(yǎng)孔進(jìn)入骨髓腔，進(jìn)入后像樹枝一樣廣泛分支。在近端進(jìn)入的神經(jīng)束，一部分分支延伸到轉(zhuǎn)子和股骨頸上方，另一部分則向下進(jìn)入骨干骨髓腔，這些分支在骨干內(nèi)常常平行排列，且延伸距離較長(zhǎng)，但不會(huì)跨越生長(zhǎng)板。在遠(yuǎn)端骨骺進(jìn)入的神經(jīng)束則終止于軟骨下骨的骨髓腔。

神經(jīng)纖維與血管的關(guān)系也十分密切。在骨髓腔中，常�？梢杂^察到神經(jīng)纖維沿著血管走行，其末端形態(tài)多樣。有的呈經(jīng)典的螺旋狀圍繞血管，有的則以游離末端的形式終止在血管附近或遠(yuǎn)離血管的地方。其中一些游離末端在其長(zhǎng)度方向上存在膨體結(jié)構(gòu)，而另一些則沒(méi)有，并且多數(shù)游離末端呈球狀。從股骨近端到遠(yuǎn)端，神經(jīng)支配密度呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在骨干的下三分之一和遠(yuǎn)端干骺端密度最低。

CGRP標(biāo)記的軸突同樣經(jīng)股骨近端頸部或遠(yuǎn)端骨骺的滋養(yǎng)孔進(jìn)入骨髓腔，進(jìn)入后沿著骨干平行向下延伸，標(biāo)記不同之處在于纖維，它們沒(méi)有螺旋狀形態(tài)，而是在長(zhǎng)度方向上有大量的膨體結(jié)構(gòu)，且大多以游離末端的形式終止在骨髓腔或靠近骨內(nèi)膜處。部分軸突還會(huì)沿著血管從骨髓腔進(jìn)入皮質(zhì)骨，或者從皮質(zhì)骨進(jìn)入骨髓腔。在骨干的下三分之一區(qū)域，偶爾會(huì)出現(xiàn)非常復(fù)雜的終止結(jié)構(gòu)，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行細(xì)絲追蹤發(fā)現(xiàn)，這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的軸突長(zhǎng)度可達(dá)約7659μm，具有102個(gè)分支點(diǎn)和65個(gè)末端。

TH標(biāo)記的神經(jīng)纖維在股骨中的分布也有其特點(diǎn)。與CGRP標(biāo)記的感覺(jué)神經(jīng)纖維不同，它在血管周圍呈現(xiàn)明顯的螺旋狀形態(tài)，且只有較少的軸突分支終止在骨髓腔或骨內(nèi)膜附近。在遠(yuǎn)端骨骺的軟骨下骨區(qū)域，有大量的TH標(biāo)記神經(jīng)纖維和末端。這些神經(jīng)纖維會(huì)穿過(guò)皮質(zhì)骨的管道，跟隨血管在骨髓腔和皮質(zhì)骨之間穿梭。在骨干的下三分之一處，還能觀察到TH標(biāo)記神經(jīng)纖維與血管之間復(fù)雜的分支關(guān)系，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)單個(gè)軸突分支并環(huán)繞兩三個(gè)相鄰血管的情況，其末端緊密貼近血管。

2、下頜骨及牙髓神經(jīng)纖維分布
對(duì)于下頜骨及牙髓的神經(jīng)支配研究也有重要發(fā)現(xiàn)。PGP9.5標(biāo)記的神經(jīng)纖維支配下頜磨牙，它們從下牙槽神經(jīng)發(fā)出，呈束狀走行，在接近磨牙及其周圍組織時(shí)逐漸分支變細(xì)。這些分支通過(guò)磨牙根的根尖孔進(jìn)入牙髓，進(jìn)入后向冠髓投射并廣泛分支，形成密集的神經(jīng)叢。此外，還有一束神經(jīng)纖維通過(guò)牙根的副根管進(jìn)入牙髓，這一發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)進(jìn)入牙髓的途徑提供了新的認(rèn)識(shí)。在磨牙周圍的組織中，如牙槽骨、牙周韌帶和牙齦等部位，也有神經(jīng)纖維的分布。一些小分支在牙槽骨中終止，部分分支進(jìn)入牙周韌帶和牙齦，其末端形態(tài)多樣，包括游離末端和其他的復(fù)雜末端，并且在牙周韌帶中形成圍繞牙根的“籃子”狀結(jié)構(gòu)。

CGRP標(biāo)記的神經(jīng)纖維在牙髓及周圍組織中廣泛分布，同樣通過(guò)根尖孔和副根管進(jìn)入牙髓，在牙髓內(nèi)形成極為密集的神經(jīng)支配網(wǎng)絡(luò)。在牙周韌帶、下頜牙槽骨（包括骨髓）和牙齦等部位，也有大量的CGRP標(biāo)記軸突分支，且大多以游離神經(jīng)末端的形式終止。通過(guò)高分辨率成像可以清晰地分辨出這些軸突在牙周韌帶中的終止結(jié)構(gòu)，它們參與構(gòu)成了圍繞磨牙的“籃子”狀結(jié)構(gòu)，為牙周組織的神經(jīng)支配提供了更詳細(xì)的信息。

TH標(biāo)記的神經(jīng)纖維在牙髓中也有較多分布，同樣通過(guò)根尖孔和副根管進(jìn)入，但通過(guò)副根管進(jìn)入的數(shù)量相對(duì)較少。在周圍組織中，TH標(biāo)記的神經(jīng)纖維主要圍繞血管分布，在牙周韌帶、下頜牙槽骨和牙齦等部位的分布相對(duì)稀疏，只有少數(shù)軸突以游離末端的形式終止在血管外，且不參與牙周組織中“籃子”狀結(jié)構(gòu)的形成。

未來(lái)研究展望
這一創(chuàng)新技術(shù)通過(guò)獨(dú)特的雙焦點(diǎn)成像方案和深度學(xué)習(xí)分類網(wǎng)絡(luò),顯著提升了大組織成像的速度和效率。在多種樣本成像實(shí)驗(yàn)中，SIFT均表現(xiàn)出卓越的性能，無(wú)論是小鼠前爪、胃，還是斑馬魚幼蟲、小鼠結(jié)腸和大腦等組織，SIFT都能以更快的速度獲取高質(zhì)量的圖像。其在空間分辨率和時(shí)間分辨率方面的優(yōu)勢(shì)，使得研究人員能夠更清晰地觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)，更及時(shí)地捕捉動(dòng)態(tài)變化。

SIFT對(duì)不同組織透明化方法適應(yīng)性強(qiáng)，在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域應(yīng)用潛力大。雖目前成像速度受相機(jī)等限制，但為ASLM技術(shù)發(fā)展提供重要思路。未來(lái)，靠改進(jìn)相機(jī)、采用更快LFA或優(yōu)化控制信號(hào)等，有望提升其性能，為生物醫(yī)學(xué)研究開拓更多可能，助力探索生命奧秘、攻克疾病難題。

通過(guò)整體透明光片三維成像技術(shù)探究神經(jīng)元亞群與骨、牙組織細(xì)胞之間的神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路，是理解神經(jīng)功能和結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。整體透明光片三維成像技術(shù)結(jié)合基因編輯、蛋白質(zhì)組學(xué)、空間組學(xué)和MERFISH等先進(jìn)技術(shù)，我們能深入研究神經(jīng)元與骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等之間的分子機(jī)制，為我們理解疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的視角，為早期診斷和治療找到潛在的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于：Thai J, Fuller-Jackson JP, Ivanusic JJ. Using tissue clearing and light sheet fluorescence microscopy for the three-dimensional analysis of sensory and sympathetic nerve endings that innervate bone and dental tissue of mice. J Comp Neurol. 2024 Jan;532(1):e25582. doi: 10.1002/cne.25582.