肺癌作為全球發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占據(jù)了肺癌病例的大多數(shù)。在NSCLC的治療中，免疫治療已成為重要手段，而PD-L1的表達(dá)水平對于預(yù)測免疫治療反應(yīng)至關(guān)重要。準(zhǔn)確評估PD-L1表達(dá)情況，能夠為患者制定更為精準(zhǔn)有效的治療方案。

傳統(tǒng)的評估方法存在一定局限性，而新的研究在這一領(lǐng)域取得了重要進(jìn)展。今天我們就來深入解讀一項關(guān)于優(yōu)化免疫熒光（IF）與高動態(tài)范圍（HDR）成像技術(shù)以提升NSCLC腫瘤組織中PD-L1表達(dá)評估的研究，看看它為肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療帶來了哪些新的曙光。

研究背景與方法
一、傳統(tǒng)病理檢測方法的現(xiàn)狀與局限
1.免疫組化（IHC）的主導(dǎo)地位
自20世紀(jì)中葉以來，H&E染色聯(lián)合免疫組化（IHC）一直是標(biāo)準(zhǔn)的病理檢測方法。在NSCLC的診斷中，IHC通過抗體與過氧化物酶激活的顯色底物相互作用，使目標(biāo)生物標(biāo)志物沉淀顯色，從而實現(xiàn)可視化定量和分布分析，在診斷新興生物標(biāo)志物如PD-L1方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是指導(dǎo)免疫檢查點(diǎn)治療選擇的重要依據(jù)。臨床生物標(biāo)志物指南目前依賴于可見光染料和模式識別，由經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家在明場顯微鏡下對IHC切片進(jìn)行量化判讀。

2.面臨的挑戰(zhàn)
僅依靠IHC觀察腫瘤空間中異質(zhì)的PD-L1分布頗具挑戰(zhàn)。腫瘤組織具有高度復(fù)雜性和異質(zhì)性，PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)并非均勻一致，不同區(qū)域、不同細(xì)胞亞群之間的表達(dá)水平可能存在顯著差異，這使得通過傳統(tǒng)IHC方法全面、準(zhǔn)確地評估PD-L1表達(dá)變得困難重重。

2.實際應(yīng)用中的阻礙
盡管IF染色在蛋白表達(dá)評估方面具有潛力，但在實際病理診斷中仍面臨諸多問題。一方面，與傳統(tǒng)顯微鏡相比，熒光顯微鏡成本效益比和處理程序復(fù)雜，限制了其在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用。另一方面，盡管努力優(yōu)化激發(fā)和發(fā)射光譜，寬熒光強(qiáng)度范圍仍可能影響成像質(zhì)量。此外，在高級生物研究中，對熒光圖像的需求急劇增加，而手動解釋暗場（IF）和明場（IHC）圖像之間的相關(guān)性因非線性人眼響應(yīng)而具有挑戰(zhàn)性，迫切需要在可承受的成本下開發(fā)先進(jìn)的探測器用于常規(guī)臨床實踐。同時，標(biāo)準(zhǔn)化的染色、成像和數(shù)字熒光圖像后處理過程對于使用熒光技術(shù)進(jìn)行常規(guī)臨床病理分析至關(guān)重要。

2.染色方法
顯色I(xiàn)HC：使用自動染色系統(tǒng)和特定抗體進(jìn)行。
IF檢測：手動進(jìn)行，包括抗原修復(fù)、與一抗和熒光標(biāo)記二抗孵育，部分使用酪酰胺信號放大（TSA）系統(tǒng)，還涉及不同組織作為陽性和陰性對照。
3D免疫熒光染色：使用100μm厚的FFPE組織切片，經(jīng)過脫蠟、抗原暴露、與抗體孵育、染色和透明處理等步驟。
圖像采集與HDR算法：使用掃描儀獲取IHC圖像，采用改進(jìn)的傳統(tǒng)HDR算法，包括圖像預(yù)處理、特定像素采樣、線性縮放和后處理等步驟。
統(tǒng)計分析：通過計算機(jī)視覺分析估計和比較PD-L1表達(dá)面積比例，由病理學(xué)家對PD-L1腫瘤比例評分（TPS）進(jìn)行判讀、分類和統(tǒng)計分析。

研究結(jié)果
一、IF和IHC圖像中PD-L1表達(dá)模式對比
1.實驗方法與樣本選擇
為確定一種能產(chǎn)生與臨床IHC檢測質(zhì)量相當(dāng)?shù)姆椒�，研究人員比較了熒光2'Ab染色方法和TSA系統(tǒng)在檢測NSCLC標(biāo)本中PD-L1表達(dá)的效果。選取了具有代表性的NSCLC組織區(qū)域樣本，包括PD-L1強(qiáng)表達(dá)、弱表達(dá)以及抗原陰性區(qū)域的標(biāo)本進(jìn)行實驗。

2.實驗結(jié)果與分析
實驗結(jié)果顯示，兩種方法在PD-L1強(qiáng)表達(dá)區(qū)域均呈現(xiàn)出與IHC相當(dāng)?shù)耐暾�膜性PD-L1模式。結(jié)果表明TSA系統(tǒng)在檢測弱表達(dá)PD-L1時具有更高的可靠性和特異性，能夠更準(zhǔn)確地反映腫瘤組織中PD-L1的真實表達(dá)情況，減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，為后續(xù)的研究奠定了更堅實的基礎(chǔ)。

二、標(biāo)準(zhǔn)IF成像過程中曝光時間的優(yōu)化
1.曝光時間對成像質(zhì)量的影響機(jī)制
直接影響圖像的對比度和亮度，進(jìn)而影響對PD-L1表達(dá)的觀察和分析。合適的曝光時間能夠確保熒光信號在臨床診斷可接受的范圍內(nèi)，避免因過亮或過暗而丟失重要信息，同時減少人為因素對熒光信號水平的干擾，保證成像條件的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

2.不同曝光時間下的實驗數(shù)據(jù)與結(jié)論
研究人員測試了低水平（6.5ms）、中等水平（25ms）和高水平（55ms）三種曝光時間對IF圖像中PD-L1表達(dá)模式的影響。通過計算機(jī)視覺方法計算不同曝光時間下IF圖像中PD-L1表達(dá)面積比例，并與相應(yīng)的IHC圖像進(jìn)行比較。結(jié)果表明，中等曝光時間下的IF圖像與IHC圖像在PD-L1表達(dá)面積比例上最為相似，中位數(shù)絕對誤差最�。�1.16%），與低水平（9.32%）和高水平（12.55%）曝光時間的IF圖像相比具有顯著差異（P<0.0003）。盡管中等曝光時間在一定程度上優(yōu)化了成像效果，但仍需進(jìn)一步改進(jìn)以克服設(shè)備動態(tài)范圍的限制，實現(xiàn)更準(zhǔn)確的PD-L1表達(dá)評估。

三、HDR處理對IF圖像動態(tài)范圍限制的改善
1.HDR處理的原理與優(yōu)勢
HDR處理旨在整合同一幻燈片上不同強(qiáng)度的IF數(shù)字信號，以克服檢測設(shè)備有限動態(tài)范圍帶來的挑戰(zhàn)。通過合并不同曝光時間的圖像，HDR算法能夠擴(kuò)展圖像的動態(tài)范圍，使原本因過暗或過亮而丟失的信息得以恢復(fù)，從而更全面、準(zhǔn)確地呈現(xiàn)PD-L1的表達(dá)模式。

2.實驗驗證與效果評估
為驗證HDR算法的有效性，研究人員對圖像進(jìn)行了有無HDR處理的對比分析，并通過計算機(jī)視覺方法比較PD-L1表達(dá)面積比例與IHC的相似性。結(jié)果顯示，HDR處理后的圖像總體誤差明顯小于未處理圖像，中位數(shù)絕對誤差分別為0.15%和1.16%，有效解決了弱信號丟失和過曝光問題。此外，HDR處理還顯著提升了病理學(xué)家之間對IF圖像TPS分類的一致性，中等曝光IF圖像經(jīng)HDR處理后，75%的病例被兩位病理學(xué)家分類到相同TPS類別，加權(quán)kappa值從0.39提高到0.69。HDR處理不僅提高了單個病理學(xué)家對PD-L1表達(dá)評估的準(zhǔn)確性，還增強(qiáng)了病理學(xué)家之間診斷的一致性，減少了主觀差異對診斷結(jié)果的影響，為臨床應(yīng)用提供了更可靠的依據(jù)。

四、HDR方法在3D免疫熒光成像中的應(yīng)用與發(fā)現(xiàn)
1.3D免疫熒光成像的實驗過程與技術(shù)要點(diǎn)
研究人員將HDR處理應(yīng)用于3D免疫熒光檢測，以全面展示PD-L1在三維空間中的表達(dá)情況。實驗采用100μm厚的FFPE組織切片進(jìn)行3D免疫熒光染色，經(jīng)過一系列復(fù)雜處理后，利用共聚焦顯微鏡獲取不同深度的圖像，并對感興趣區(qū)域（ROI）進(jìn)行高分辨率采集。通過HDR處理整合各層圖像信息，以揭示PD-L1在腫瘤組織不同深度的真實表達(dá)和變化規(guī)律。

2.3D免疫熒光成像結(jié)果與意義
在3D熒光成像中，研究觀察到了弱信號丟失和強(qiáng)信號過曝光的問題，但經(jīng)過HDR處理后，IF圖像在PD-L1模式上呈現(xiàn)出完整的著色，清晰顯示出膜染色。通過HDR處理對3D各層圖像的分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織不同深度的PD-L1表達(dá)存在顯著差異，如在某樣本中，表層PD-L1 TPS為40%，而底層為15%。HDR處理后的串行圖像經(jīng)3D渲染后，能夠直觀展示PD-L1在腫瘤組織中的三維分布情況。這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了HDR處理在2D和3D熒光成像中的重要性，無需進(jìn)行硬件升級即可顯著提升成像質(zhì)量，為深入研究腫瘤微環(huán)境中PD-L1的分布提供了有力工具，有助于更全面地理解腫瘤生物學(xué)行為，為精準(zhǔn)治療提供更豐富的信息。

研究結(jié)論
一、技術(shù)應(yīng)用與評估效果
TSA系統(tǒng)結(jié)合調(diào)整成像條件和HDR處理，在NSCLC腫瘤組織中PD-L1表達(dá)的2D和3D病理評估中具有良好的臨床應(yīng)用價值。優(yōu)化后的數(shù)字IF圖像制備過程，在不同深度的肺腫瘤組織中，對于不同水平的PD-L1表達(dá)評估展現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確性和可靠性，其質(zhì)量與傳統(tǒng)IHC圖像相當(dāng)，且能提供更精確的PD-L1表達(dá)可視化效果，尤其是在展示腫瘤環(huán)境不同深度的PD-L1表達(dá)變化方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)IHC測試在這方面的不足。

二、對肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療的推動作用
1.精準(zhǔn)診斷與治療決策
通過更準(zhǔn)確地評估PD-L1表達(dá)，醫(yī)生能夠更精準(zhǔn)地判斷患者對免疫治療的反應(yīng)，從而為患者制定個性化的治療方案。對于PD-L1高表達(dá)的患者，免疫治療可能更為有效，而對于低表達(dá)患者，則可考慮其他治療策略，避免不必要的治療和副作用，提高治療效果，改善患者預(yù)后。

2.深入理解腫瘤生物學(xué)行為
3D病理分析PD-L1分布為研究腫瘤微環(huán)境提供了更豐富的信息，有助于深入理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制。這不僅有助于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和策略，還能為監(jiān)測治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展提供更敏感的指標(biāo)，推動肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療從診斷到治療的全方位發(fā)展。

三、研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性
1.創(chuàng)新點(diǎn)
本研究的創(chuàng)新之處在于優(yōu)化了PD-L1 IF檢測的全過程，包括染色、成像和后處理，特別是將HDR算法應(yīng)用于IF圖像，有效解決了熒光顯微鏡檢測系統(tǒng)動態(tài)范圍有限的問題，顯著提高了PD-L1表達(dá)評估的準(zhǔn)確性和一致性。此外，將該方法成功擴(kuò)展到3D免疫熒光成像，為研究腫瘤組織中PD-L1的三維分布提供了可行方案，這在以往研究中較少涉及。

2.局限性
盡管取得了重要成果，但研究仍存在一定局限性。例如，研究樣本量相對有限，可能無法完全代表所有NSCLC患者的情況。此外，雖然HDR處理提高了IF圖像的診斷價值，但病理學(xué)家對IF圖像的解讀仍不如對IHC圖像熟悉，可能需要額外的培訓(xùn)和更多的臨床實踐來提高其應(yīng)用水平。未來研究可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，探索更有效的培訓(xùn)方法，以推動該技術(shù)在臨床實踐中的廣泛應(yīng)用。

這項研究在NSCLC的PD-L1表達(dá)評估領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，為肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療帶來了新的希望和方向。通過優(yōu)化免疫熒光技術(shù)與高動態(tài)范圍成像的結(jié)合，我們在提高PD-L1表達(dá)評估準(zhǔn)確性方面邁出了重要一步。然而，要將這些研究成果真正轉(zhuǎn)化為臨床實踐中的有效工具，仍需要廣大科研人員和醫(yī)務(wù)工作者的共同努力。未來，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和研究的深入拓展，相信我們將能夠更好地應(yīng)對肺癌這一重大疾病挑戰(zhàn)，為患者帶來更多的生存希望和生活質(zhì)量改善的機(jī)會。讓我們共同期待在肺癌精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域取得更多的突破和創(chuàng)新。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：Huang, HN., Kuo, CW., Hung, YL. et al. Optimizing immunofluorescence with high-dynamic-range imaging to enhance PD-L1 expression evaluation for 3D pathology assessment from NSCLC tumor tissue. Sci Rep 14, 15176 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-65187-x.