細(xì)胞計數(shù)實驗具體操作分享
細(xì)胞計數(shù)實驗原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。
具體操作：
一.準(zhǔn)備工作：
取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。
二.細(xì)胞懸液制備：
細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。
三.細(xì)胞計數(shù)：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。
2.制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。
3.將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
5.計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度：
（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝ （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×2×104
說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
四.細(xì)胞計數(shù)要點：
1.進行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；
2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。
3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；
4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團時，只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。
5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。
五.初學(xué)者易犯的錯誤：
1. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。
2. 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
3. 滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。
六.本實驗特殊試劑的配制：
4％臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。
具體操作：
一.準(zhǔn)備工作：
取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。
二.細(xì)胞懸液制備：
細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。
三.細(xì)胞計數(shù)：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。
2.制備計數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。
3.將細(xì)胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
5.計算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計算細(xì)胞密度：
（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝ （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×2×104
說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以2因為細(xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
四.細(xì)胞計數(shù)要點：
1.進行細(xì)胞計數(shù)時，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；
2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。
3.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數(shù)準(zhǔn)確；
4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團時，只按照一個細(xì)胞計算。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。
5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數(shù)。
五.初學(xué)者易犯的錯誤：
1. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。
2. 滴入細(xì)胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
3. 滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。
六.本實驗特殊試劑的配制：
4％臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4℃保存。
使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4％即可。
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