在新一代測(cè)序技術(shù)中，PacBio測(cè)序平臺(tái)往往因通量小和一直以來(lái)的關(guān)于準(zhǔn)確率低的謠言而被忽視，但事實(shí)上，超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、實(shí)時(shí)檢測(cè)堿基修飾、超高精度這三個(gè)特點(diǎn)正使得SMRT成為完成小基因組完整測(cè)序的最理想工具。    

在啟動(dòng)大量經(jīng)費(fèi)進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序時(shí)，理性地進(jìn)行項(xiàng)目評(píng)估是必須要率先邁開(kāi)的一步。如果對(duì)某個(gè)5.2 Mb炭疽基因組（B._anthracis Ames Ancestor）進(jìn)行讀長(zhǎng)評(píng)估的例子，同樣的覆蓋度下，100 bp（二代測(cè)序）讀長(zhǎng)最終獲得98個(gè)Contig，1000 bp（三代測(cè)序）讀長(zhǎng)最終獲得31個(gè)Contig，5000 bp讀長(zhǎng)最終獲得1個(gè)Contig。基于短讀長(zhǎng)和偏好擴(kuò)增的二代技術(shù)實(shí)現(xiàn)的只能是大量的片段化組裝，要完成完整或精細(xì)組裝還需要額外的實(shí)驗(yàn)操作和后續(xù)測(cè)序，總費(fèi)用將非常昂貴。

Finished bacterial genomes from shotgun sequence data.和Reducing assembly complexity of microbial genomes with single-molecule sequencing. 兩篇文章中都提到了測(cè)序評(píng)估和成本比較，這個(gè)成本是在完成基因組完整測(cè)序的基礎(chǔ)上計(jì)算的，而且不再是以往的以$/Mb計(jì)算，因?yàn)樯钪O測(cè)序韜略的有識(shí)之士心里都清楚，單純的數(shù)字游戲是不能給項(xiàng)目成本預(yù)算提供任何實(shí)質(zhì)性幫助的。

美國(guó)國(guó)家生化防衛(wèi)分析與對(duì)策中心（NBACC）的Sergey Koren和Adam Phillippy以及美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）的Timothy Smith等人。他們?yōu)榱嗽u(píng)估測(cè)序項(xiàng)目，在數(shù)據(jù)庫(kù)中找了2267種已經(jīng)獲得完整基因組圖譜的微生物和古菌，并根據(jù)內(nèi)部重復(fù)序列的長(zhǎng)度分成三類：第一類在數(shù)量上占69.07%，基本上只含有0.5-5 Kb長(zhǎng)度的重復(fù)序列；第二類占7.59%，主要含5-7 Kb長(zhǎng)度的重復(fù)序列；第三類占23.33%，含有7 Kb以上長(zhǎng)度的重復(fù)序列。然后他們分別采用代表二代的500 bp讀長(zhǎng)序列和代表三代的5000 bp讀長(zhǎng)序列，通過(guò)軟件算法進(jìn)行模擬拼接，主要評(píng)估讀長(zhǎng)能否在全基因組范圍內(nèi)跨越所有的重復(fù)序列，以Gap數(shù)量作為最終評(píng)估指標(biāo)，而覆蓋度方面，二代假設(shè)成無(wú)限程度覆蓋模式，三代僅用50-200X。最終的結(jié)果是：第一類中，以Bacillus anthracis Ames為例，三代方法能拼成完整圖，但二代方法還留有20個(gè)Gap；第二類中，以Yersinia pestis CO92為例，三代方法同樣能拼成完整圖，但二代方法還留有161個(gè)Gap；第三類中，以Escherichia coli O26:H11 11368為例，三代方法僅留有16個(gè)Gap，但二代方法還留有171個(gè)Gap�？紤]到以上只是軟件模型模擬出來(lái)的結(jié)果，他們還專門(mén)選擇了6個(gè)菌株分別在PacBio、454、MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行實(shí)際測(cè)序，最終驗(yàn)證了這一模型的可靠性。且PacBio經(jīng)Quiver打磨后的精度達(dá)到并超過(guò)了99.99995%，而一般完成基因組完整圖的精度級(jí)別在99.999%，所以PacBio在精度上完全勝任。

那么后續(xù)的補(bǔ)洞費(fèi)用到底有多高昂呢，或者說(shuō)真正意義上獲得完成圖的總費(fèi)用到底是多少呢？！直接綜合兩篇文章（Finished bacterial genomes from shotgun sequence data. Genome Res 2012, 22:2270-2277.和Reducing assembly complexity of microbial genomes with single-molecule sequencing. [http://arxiv.org/abs/1304.3752]）的分析，費(fèi)用數(shù)據(jù)主要來(lái)自Duke大學(xué)和Illinois大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和外部合作機(jī)構(gòu)，我們來(lái)看下總的結(jié)果。假如用Illumina平臺(tái)對(duì)5 Mb基因組進(jìn)行測(cè)序，采用ALLPATHS組裝，之后預(yù)留50個(gè)Gap必須手工填補(bǔ)，總共需要花費(fèi)$ 13,124。如果這些Gap后續(xù)用PacBio長(zhǎng)片段測(cè)序去填補(bǔ)，成本直接縮小至$2,952。那么這個(gè)成本算是終極廉價(jià)了嗎？就怕你不敢想象！不要忘了，NGS測(cè)序容易引入系統(tǒng)誤差，尤其是早期NGS系統(tǒng)。既然如此，不如干脆忘掉早期NGS數(shù)據(jù)，推倒重來(lái)吧！假如換成PacBio從頭測(cè)序，用沒(méi)有升級(jí)的RS系統(tǒng)，一個(gè)SMRT Cell產(chǎn)出125 Mb數(shù)據(jù)量，那么一個(gè)5 Mb基因組需要花費(fèi)6個(gè)SMRT Cell（100-150X），成本是$1,625，得到完整基因組圖譜。更進(jìn)一步，假如換成升級(jí)后的RS II系統(tǒng)，用XL-C2試劑盒，一個(gè)SMRT Cell的通量大約500 Mb，僅用一個(gè)SMRT Cell就可以獲得100X覆蓋度，算上建庫(kù)、質(zhì)控、測(cè)序耗材總共花費(fèi)為$ 636.96，得到的就是完整基因組圖譜，不需要后續(xù)補(bǔ)洞。文章作者沒(méi)有進(jìn)一步計(jì)算，但考慮到PacBio在2013年Q4又推出了P5試劑盒，平均讀長(zhǎng)達(dá)到了8500 bp，通量達(dá)到了0.8-1 Gb/SMRT Cell，如此一來(lái)，對(duì)一個(gè)5 Mb基因組進(jìn)行從頭測(cè)序，僅需$400。$13,124+X（X為Illumina測(cè)序成本）對(duì)比$400。

因此，無(wú)論從項(xiàng)目評(píng)估和測(cè)序成本兩方面進(jìn)行考量，三代測(cè)序技術(shù)都是最優(yōu)的，更何況還可以在測(cè)序同時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)堿基修飾，這也無(wú)怪乎業(yè)界已經(jīng)將三代測(cè)序定義為微生物測(cè)序領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。評(píng)估考核還可以適當(dāng)引申到當(dāng)下炙手可熱的臨床樣本靶向測(cè)序領(lǐng)域，這需要從通量的角度上去做理性的選擇。比如在樣本數(shù)量不多的前提下，那么就完全可以選擇三代作為主導(dǎo)做單倍體分型、稀有突變鑒定、mRNA可變剪切、未知堿基修飾等精細(xì)分析，但如果樣本數(shù)動(dòng)輒幾萬(wàn)例，那么只能選擇高通量的二代作為主導(dǎo)做傳統(tǒng)的已知突變篩查等工作，此時(shí)三代可以在復(fù)雜基因分型場(chǎng)合作配合驗(yàn)證。所以三代測(cè)序還有必要在通量上不斷尋求突破，就技術(shù)而言，這是它與二代相比的唯一弱點(diǎn)。

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