DAP-seq助力揭示蘋果轉(zhuǎn)錄因子MYB54調(diào)節(jié)細胞壁防御機制
2024年12月11日，西北農(nóng)林科技大學(xué)馬鋒旺-李超團隊在The Plant Journal期刊（IF=6.2）發(fā)表了題為“MdMYB54 reduces disease severity caused by Fusarium solani in apple by modulating cell wall cellulose and pectate lyase-dependent defense”的研究論文，該文章借助DAP-seq技術(shù)，揭示了蘋果MYB54轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)細胞壁纖維素和果膠裂解酶依賴的防御機制以減輕病害。
研究背景
蘋果是四大水果之一，但是蘋果種植面臨再植病 (ARD)問題，影響植株生長、果實品質(zhì)和產(chǎn)量，這主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium solani）引起。植物進化出復(fù)雜遺傳調(diào)控因子來抵抗生物和非生物脅迫，MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物脅迫響應(yīng)，但在蘋果抗F. solani中的作用及機制尚不清楚。植物細胞壁是抵御病原體入侵的第一道屏障，纖維素含量增加有助于增強植物抗病性，果膠裂解酶可觸發(fā)細胞壁防御反應(yīng)，但 MYB 轉(zhuǎn)錄因子如何通過誘導(dǎo)細胞壁防御反應(yīng)抵抗F. solani仍有待探索。
研究結(jié)果
前期研究結(jié)果表明，MdERF114通過調(diào)控MdPRX63的轉(zhuǎn)錄顯著增強了蘋果根部對尖孢鐮刀菌的抗性。作者通過Y2H（酵母雙雜交系統(tǒng)）篩到與MdERF114的互作蛋白MdMYB54，并通過pull-down、Y2H、熒光素酶互補（Split-LUC）實驗證實MdMYB54與MdERF114在體外和體內(nèi)均直接相互作用。MdMYB54定位于細胞核，其啟動子中存在多個與脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。且受F. solani、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）誘導(dǎo)，在蘋果根中高表達。
蘋果是四大水果之一，但是蘋果種植面臨再植病 (ARD)問題，影響植株生長、果實品質(zhì)和產(chǎn)量，這主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium solani）引起。植物進化出復(fù)雜遺傳調(diào)控因子來抵抗生物和非生物脅迫，MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛參與植物脅迫響應(yīng)，但在蘋果抗F. solani中的作用及機制尚不清楚。植物細胞壁是抵御病原體入侵的第一道屏障，纖維素含量增加有助于增強植物抗病性，果膠裂解酶可觸發(fā)細胞壁防御反應(yīng)，但 MYB 轉(zhuǎn)錄因子如何通過誘導(dǎo)細胞壁防御反應(yīng)抵抗F. solani仍有待探索。
研究結(jié)果
前期研究結(jié)果表明，MdERF114通過調(diào)控MdPRX63的轉(zhuǎn)錄顯著增強了蘋果根部對尖孢鐮刀菌的抗性。作者通過Y2H（酵母雙雜交系統(tǒng)）篩到與MdERF114的互作蛋白MdMYB54，并通過pull-down、Y2H、熒光素酶互補（Split-LUC）實驗證實MdMYB54與MdERF114在體外和體內(nèi)均直接相互作用。MdMYB54定位于細胞核，其啟動子中存在多個與脅迫和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。且受F. solani、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）誘導(dǎo)，在蘋果根中高表達。
圖1 MdMYB54與MdERF114相互作用
為研究MdMYB54基因在蘋果根對F. solani的作用，作者構(gòu)建了MdMYB54-OE和MdMYB54-RNAi材料。 MdMYB54-OE增強了蘋果根對F. solani的抗性，表現(xiàn)為植株生長受抑制程度減輕、根相對電導(dǎo)率（REL）和丙二醛（MDA）含量降低、根活性提高、根部病斑數(shù)量和面積減少；RNAi株系則表現(xiàn)出相反結(jié)果。
圖2 MdMYB54正向調(diào)控蘋果植株對Fusarium solani的抗性
使用DAP-seq技術(shù)檢測MYB54在全基因組水平上的結(jié)合位點。22%的結(jié)合位點位于基因啟動子區(qū)，36%位于遠端基因間區(qū)，10%位于基因下游區(qū)域，6%位于于外顯子區(qū)。通過Meme分析發(fā)現(xiàn)兩個高度富集的MdMYB54結(jié)合位點。DAP-qPCR結(jié)果顯示，MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子區(qū)與對照相比，富集倍數(shù)顯著增加。KEGG通路富集分析顯示，MdMYB54靶基因參在戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、MAPK信號通路、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物-病原體相互作用通路中顯著富集。GO分析發(fā)現(xiàn)，靶基因在乙烯、水楊酸和缺水響應(yīng)等分子功能上顯著富集，說明MdMYB54可能與脅迫響應(yīng)、植物生長發(fā)育有關(guān)。
圖3 MdMYB54靶基因的鑒定
電泳遷移率測定（EMSA）和酵母單雜交（Y1H）實驗結(jié)果顯示，MdMYB54在體內(nèi)外直接與MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子結(jié)合。雙熒光素酶（Dual-Luc）和葡萄糖醛酸酶（GUS）實驗顯示，MdMYB54激活了這些基因的表達。
圖4 MdMYB54對MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的轉(zhuǎn)錄激活作用
F. solanii處理下，MdMYB54過表達根系纖維素含量和果膠裂解酶活性顯著高于野生型植株，而在MdMYB54-RNAi根系中則相反。
圖5 纖維素含量和果膠裂解酶活性的測定
為了進一步研究MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12在F. solanii感染中的作用，作者構(gòu)建了MdCesA6-OE，MdPLL8-OE，和MdPLL12-OE材料。發(fā)現(xiàn)過表達MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12增強了蘋果根對F. solani的抗性，表現(xiàn)為植株生長改善、根損傷減輕、REL和MDA含量降低、根活性提高。
圖6 MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12過表達增強了蘋果對F. solani的抗性
為研究MdERF114和MdMYB54的相互作用是否影響MdMYB54對MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的調(diào)控，作者進行了GUS、雙熒光素酶測定實驗。結(jié)果表明，MdERF114和MdMYB54之間的相互作用促進MdMYB54激活MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12啟動子的激活，增強蘋果對F. solani的抗性。
圖7 MdERF114促進了MdMYB54與MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12啟動子的結(jié)合
實驗結(jié)論
MdMYB54 是蘋果中抵抗F. solani的正調(diào)控因子，與MdERF114相互作用，通過直接結(jié)合并激活細胞壁相關(guān)基因MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子，增強纖維素沉積和果膠裂解酶活性，提高蘋果對F. solani的抗性。研究揭示了MdMYB54在F. solani感染蘋果根中的調(diào)控機制，為理解其在緩解蘋果再植病挑戰(zhàn)中的作用提供了依據(jù)，為提高蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)、培育優(yōu)良砧木新品種奠定了理論基礎(chǔ)。
MdMYB54 是蘋果中抵抗F. solani的正調(diào)控因子，與MdERF114相互作用，通過直接結(jié)合并激活細胞壁相關(guān)基因MdCesA6、MdPLL8和MdPLL12的啟動子，增強纖維素沉積和果膠裂解酶活性，提高蘋果對F. solani的抗性。研究揭示了MdMYB54在F. solani感染蘋果根中的調(diào)控機制，為理解其在緩解蘋果再植病挑戰(zhàn)中的作用提供了依據(jù)，為提高蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)、培育優(yōu)良砧木新品種奠定了理論基礎(chǔ)。
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