期刊：Science China-Life Sciences
影響因子：8.0
單細胞測序概述
單細胞測序（Single-cell RNA sequencing; scRNA-seq）是一種開創(chuàng)性的單細胞測序技術，現(xiàn)在已得到廣泛普及，并涵蓋了多種方法。盡管方法多種多樣，但它們都遵循類似的一般過程，包括四個主要步驟：（i）單細胞分離、（ii）逆轉錄（RT）、（iii）cDNA 擴增和（iv）測序文庫構建和測序（Hedlund and Deng，2018）。scRNA-seq工作流程的主要步驟如圖 3所示。本節(jié)概述了與單細胞分離和測序文庫構建相關的一些技術和解決方案。

（1）單細胞分離
在scRNA-seq中，第一步也是關鍵的一步是單細胞分離，其中組織解離和單細胞分離被認為是造成污染、批次效應和程序差異的重要因素（Tung等，2017）。因此，要進行高通量和無偏差的單細胞測序，高效、可靠、準確捕獲單細胞是關鍵決定因素。早期的單細胞分離方法包括有限連續(xù)稀釋 ( Gross等，2015 )、手動顯微操作 ( Hu等，2016a )和激光捕獲顯微切割 (LCM)( Emmert-Buck等，1996 )，這些方法通量低、耗時、效率低、技術難度大，但仍用于分析少量細胞（例如稀有細胞）( Dal Molin and Di Camillo, 2019 )。

流式細胞熒光分選 (FACS)是一種常用的高通量技術，可特異性地自動分離數(shù)千個單個細胞，但對細胞數(shù)量的需求很大（需要分離的細胞數(shù)量 >10,000）( Hu等，2016a )。此外，由于熒光信號微弱，該技術不適用于某些標志物表達較低的細胞，因此很難區(qū)分具有相似標志物表達的亞群 ( Yasen等，2020 )。磁激活細胞分選 (MACS)是另一種高通量分離技術，旨在通過與磁珠結合的酶、凝集素、抗體或鏈霉親和素分離各種細胞類型，從而促進特定蛋白質與靶細胞的結合 ( Hu等，2016a )。MACS 系統(tǒng)具有顯著的優(yōu)勢，可在特定細胞群中實現(xiàn) 90% 以上的純度 ( Miltenyi等，1990 )。然而，與 FACS 相比，MACS 具有固有的局限性，因為免疫磁技術只能將細胞分離為陰性和陽性細胞群。此外，它不能根據(jù)分子的低表達或高表達來分離細胞，而 FACS 可以做到這一點 ( Hu等，2016a )。在當前的高通量測序平臺中，基于微流體的單細胞操作方法已成為轉錄組研究中單細胞分離的主要技術，這種技術顯著提高了分離過程的規(guī)模、效率和準確性。微流體裝置使用反應室或液滴捕獲細胞，然后分別進行單獨的納升水平的反應步驟，提供了更經濟且樣品效率更高的分析方法。這些裝置主要分為基于微孔的方法、基于液滴的方法和集成流體回路 (IFC)。微流控系統(tǒng)在 scRNA 測序中的集成顯著提高了測序通量，能夠同時處理和分析數(shù)以萬計的單細胞。表S2 全面概述了當前的單細胞分離技術，包括其優(yōu)點和局限性。

（2）逆轉錄和 cDNA 擴增
單個哺乳動物細胞含有的 RNA總量約 10 pg，其中主要部分由核糖體RNA (rRNA)和轉運RNA (tRNA)組成，而信使RNA (mRNA)僅占總量的1%–5%（Liu等，2014 ; Wang等，2023c）。由于單細胞中mRNA含量極低，因此必須在逆轉錄后對cDNA進行擴增，以獲得大量用于測序文庫制備的樣本。cDNA擴增可以通過使用聚合酶鏈式反應 (PCR)的指數(shù)擴增或基于體外轉錄 (IVT)的線性擴增來實現(xiàn)。

目前，文庫構建的主要方法是基于 PCR 的 cDNA 擴增，包括 poly(A)加尾和模板轉換 (TS)方法（Kolodziejczyk等，2015）。poly(A)加尾法使用 oligo-dT 引物與 mRNA 3′-poly(A)尾結合，將mRNA 逆轉錄為 cDNA。poly(A)加尾法速度快但不能捕獲非多聚腺苷酸化（Poly(A)−）RNA（Hebenstreit，2012），且捕獲效率低，文獻報道現(xiàn)行捕獲方法的捕獲效率約為10%–15%（Islam等，2014）。此外，逆轉錄酶反應的終止還可能導致轉錄中 mRNA 5′端的覆蓋率降低。TS 技術利用莫洛尼鼠白血病病毒 (MMLV)逆轉錄酶進行 TS 過程。MMLV 逆轉錄酶可以在新合成的單鏈尾端附加一個 poly(C)尾。poly(C)尾可以與模板轉換寡核苷酸 (TSO)接頭序列的 5′端 poly(G)尾結合。在這一互作之后會發(fā)生一個“切換”：逆轉錄酶以TSO為模板合成cDNA，完成銜接子的轉換（Picelli，2017）。TS法相對來說不易發(fā)生核酸丟失，但與poly（A）加尾法相比靈敏度較低�；�于PCR的擴增雖然能夠在短時間內快速有效地擴增大量cDNA，但受到指數(shù)擴增過程固有特性的制約。PCR傾向于擴增較短和GC含量較低的擴增子，從而導致定量偏差和非特異性轉錄本的積累，從而導致原始轉錄本信息的丟失（Aird等，2011）。此外，PCR會導致最終文庫中高表達的轉錄本過多（Aird等，2011）。

IVT代表了另一種cDNA合成和擴增的方法。IVT 的主要優(yōu)勢在于其線性擴增，這一特性可減輕人們通常所說的擴增偏好，使其比 PCR 更精確、重復性更好 ( Chen等，2017a ; Grün and van Oudenaarden, 2015 )。在該策略中，一條oligo-dT 引物最初與 mRNA 的 3′-poly(A)尾結合，合成兩條 cDNA 鏈，該引物包含(i)唯一分子標識符 (UMI，具有標記單個 mRNA分子的隨機核苷酸序列，用于量化唯一轉錄本和糾正擴增偏好性)；(ii)唯一的細胞條形碼（barcode）；(iii)Illumina 接頭；和(iv)T7 啟動子。將擴增的 RNA 分子重新轉換為 cDNA需要另一輪逆轉錄，以便構建測序文庫。因此，得到的 cDNA 在 3′端的覆蓋度上存在明顯的偏差。此外，這種方法耗時耗力，使之與 PCR 相比，沒有得到廣泛的應用（Hashimshony 等人，2012）。

作為 scRNA-seq的一個獨特步驟，所有來自單個細胞的轉錄本都會獲得一個獨特的barcode-在逆轉錄期間引入 cDNA 的短寡核苷酸序列，用于區(qū)分單個細胞的轉錄組。利用獨特的barcode信息，這些轉錄本就可以被很容易地對應到各自歸屬的細胞中去。因此，在每個細胞都用唯一的barcode標記后，大量單細胞轉錄組才能被合并在一起，用于構建文庫，然后在一次運行中完成后續(xù)測序。這種方法顯著降低了成本并提高了測序通量。細胞barcode是一種非常有效的并行處理策略，2011首次用于 STRT-seq方法（Islam等，2011）。隨后，2014， Islam 等人進一步創(chuàng)新，引入了 UMI 來識別細胞內的每個 cDNA 分子。與細胞barcode一樣，UMI 也是一個由 6–8 個堿基對組成的隨機寡核苷酸序列，可以在逆轉錄過程中整合到細胞內的每一個轉錄本中。大量的UMI序列可以讓每個轉錄本都帶上不同的標記，從而確保通過 PCR 擴增產生的所有重復分子都保留原始轉錄本的UMI。通過計算UMI，就可以對轉錄本的原始拷貝數(shù)進行精準的定量，從而消除 PCR 擴增的偏好性。

針對單細胞 RNA 測序的三個關鍵問題：（i）單細胞分離；（ii）最大限度地減少逆轉錄期間的RNA損失；以及 (iii)產生足夠的DNA進行測序，研究人員近年來進行了許多技術方面的探索，導致了各種 scRNA-seq方法的提出，專門用于單細胞轉錄組學的全面研究。

不同的 scRNA-seq技術都基于共同的基本原理，但它們在以下至少一個方面有所不同：(i)單細胞分離；(ii)逆轉錄；(iii)cDNA 擴增；(iv)轉錄本覆蓋；(v)UMI；(vi)鏈特異性。每種方法都有其獨特的優(yōu)勢和局限性。這些不同的 scRNA-seq技術的主要特征合并整理在表S1 中。因此，研究人員可以根據(jù)技術特點、優(yōu)勢、成本因素和通量需求靈活地選擇合適的 scRNA-seq方法。
 

圖3. 單細胞測序工作流程的主要步驟

當前可用的 scRNA-seq 技術
低通量 scRNA-seq 技術
如表S1 中所述，scRNA-seq已經開發(fā)出了60多種不同的方法�？傮w來說，這些方法可以分為兩大類：低通量方法和高通量方法。低通量方法發(fā)展出的基本化學方法旨在提高測序的靈敏度和準確性，同時降低成本和技術噪音。其中，靈敏度是最為重要的關鍵特性，也是評估方法性能的基本指標。高通量方法的基本化學原理也是從幾種經典低通量方法中發(fā)展而來的。我們將在下面詳細討論這些技術。

（1）Tang's protocol
Tang's protocol于2009年由Surani課題組開發(fā)，是一種具有開創(chuàng)性的scRNA-seq方法。在該技術中，單個小鼠胚泡是利用一臺顯微鏡來手動進行選擇的。隨后解列細胞，用帶有錨定序列（UP1）的 poly(T)引物將 mRNA 逆轉錄為 cDNA，并在末端轉移酶的幫助下將 poly(A)尾添加到第一鏈末端的尾端。此后，使用帶有另一個錨定序列（UP2）的第二條 poly(T)引物合成第二鏈 cDNA。在此之后，使用 UP1 和 UP2 引物通過PCR對cDNA進行高效擴增，構建文庫，最后在SOLiD系統(tǒng)上進行測序。該方法可以生成幾乎全長的轉錄本 cDNA 并檢測約 13,000 個基因（Tang等，2009）。該技術的主要用途是幫助揭示新的轉錄本和可變剪接異構體。

盡管該技術代表了當時新興的scRNA-seq領域的重大進步，但它也有很多局限性。首先，該方法只能識別具有poly(A)尾的 mRNA；它不能捕獲沒有poly(A)尾的 mRNA，例如組蛋白 mRNA、miRNA、環(huán)狀 RNA（circRNA）和新生 RNA。這是因為該方法需要依賴于poly(T)引物通過poly(A)尾來捕獲mRNA，進而起始逆轉錄反應。其次，酶反應效率低下導致測序靈敏度降低，從而導致低表達轉錄本的丟失。第三，這種方法不是鏈特異性的，不能區(qū)分正義和反義轉錄本。因此，它沒有被廣泛使用。

（2）STRT-seq
2011年，Islam 等人（2011）開發(fā)了一種單細胞標記逆轉錄測序 (single-cell tagged reverse transcription sequencing，STRT-seq)方法，這是一種基于Illumina 平臺多重測序的scRNA-seq方法。該方法在逆轉錄過程中通過模板切換機制引入barcode和上游引物結合序列，促進 3′端鏈特異性擴增以及高通量96細胞多重測序。STRT-seq在基于陣列的測序策略基礎上，支持處理多達 800 個單個細胞。該方法的一個關鍵優(yōu)勢是它可以在逆轉錄過程中為每個細胞添加獨特的barcode序列，從而能夠大規(guī)模檢測各種混合細胞樣本，例如高度異質性的腫瘤細胞樣本。與Tang’s protocol相比，STRT-seq通過提前加入barcode的策略顯著降低了成本和處理時間。然而，該方法中包含了多個PCR循環(huán)，可能會引入PCR偏差。該方法在生物醫(yī)學領域有許多應用，包括探究腫瘤異質性、識別潛在的用于疾病的診斷和治療的新型生物標志物或者藥物靶點（Cui等，2021 ；Song等，2022a ；Tian等，2022）。（3）Smart-seq

2012， Ramsköld 等人開發(fā)了一種可靠、穩(wěn)定的 scRNA-seq方法 Smart-seq，該方法最顯著的進步是通過轉錄本前端的切換機制，在轉錄本全長 cDNA 合成中達到超過40%的效率。該技術的發(fā)表是 scRNA-seq研究領域的一個里程碑。Smart-seq的核心原理是利用 poly(T)引物和 SMART-TS 技術將多聚腺苷酸化（poly(A)+）RNA 轉換為全長 cDNA。得到的cDNA分子經PCR擴增后，通過Nextera Tn5轉座子技術構建Illumina測序文庫，該方法顯著提高了檢測可變剪接外顯子和低豐度表達轉錄本的能力。smart-seq方法在醫(yī)學領域有著廣泛的應用，如分析膽道閉鎖小鼠模型肝臟中CD177+細胞的基因表達譜（Zhang等，2022d）；分析骨骼肌干細胞、不同生態(tài)位的細胞和單根肌纖維的全基因組表達（Blackburn等，2019 ；Blackburn等，2021）；研究急性皮膚紅斑狼瘡患者與正常對照組真皮CD4 + Trm細胞的差異（Zhao等，2022c）。

Smart-seq2被開發(fā)出來是為了克服 Smart-seq中存在的覆蓋范圍有限、cDNA擴增產量較低和靈敏度不夠等問題（Picelli 等人，2013）。為了增加 cDNA 文庫的產量和長度，Smart-seq2進行了幾項改進，包括增強逆轉錄、TSO 和PCR重新擴增。與 Smart-seq相反，Smart-seq2是通過在 TSO 的 3 '端加入鎖核酸 (LNA)鳥苷酸，使得cDNA 產量顯著提高至大約兩倍。這種改善與LNA-DNA堿基對的熱穩(wěn)定性增強有關。此外，該技術通過添加甲基供體甜菜堿以及更高濃度的 MgCl2，使得cDNA 產量大幅增加。另一方面，不直接將脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)加入RT主混合物中，而是在RNA 變性之前才加入反應體系，這樣可以增加預擴增cDNA的平均長度。上述改進可能是由RNA 與oligo-dT 引物雜交穩(wěn)定性提高所導致的。KAPA HiFi Hot Start DNA 聚合酶的應用改善了cDNA的生成并增加了cDNA的長度。Smart-seq2 轉錄組文庫在檢測強度、覆蓋率、偏差和準確性方面均優(yōu)于 Smart-seq。Smart-seq2 轉錄組文庫的建立可以使用成本更低的現(xiàn)成試劑，使得深入分析每個轉錄本的全外顯子和檢測不同的剪接變體成為可能。該方法還有助于徹底分析單核苷酸多態(tài)性 (SNP)和突變。然而，該方法也存在局限性，例如缺乏鏈特異性和無法檢測 poly(A)− RNA（Picelli等，2014）。此外，使用微量移液器的細胞分離過程較為耗時且通量低。

（3）Smart-seq3
通過優(yōu)化逆轉錄和模板轉換的條件，提高了靈敏度（HagemannJensen等，2020）。優(yōu)化的參數(shù)包括使用Maxima H-minus逆轉錄酶、將逆轉錄鹽從KCl轉換為NaCl或CsCl、在體系中存在5% 聚乙二醇 (PEG)的條件下進行逆轉錄，以及加入GTP或dCTP來增強和穩(wěn)定模板轉換反應等。Smart-seq3 的一個顯著特點是它將全長轉錄組覆蓋與 5′UMI RNA計數(shù)策略相結合，從而無需犧牲整體覆蓋率即可提高轉錄本計數(shù)的精度。這種方法構建了一個TSO引物，包含Tn5基序的一部分、11 個堿基對的標簽序列、8 個堿基對的 UMI 序列和三個核糖鳥苷。測序后，利用上述11 個堿基對的標簽就可以明確區(qū)分 5′UMI 標記的reads和內部reads，在單次測序反應中就可以收集5′UMI標記的reads和不帶 UMI 的整個轉錄本的內部reads。這種方法允許利用UMIreads對原始轉錄本進行準確量化，從而校正非線性PCR擴增偏差，通過使用內部reads就可以重建全長轉錄本。當前的很多測序文庫構建方法結合了細胞barcode和 UMI 標簽策略。然而，由于這些標簽只能引入到cDNA的末端，因此得到的用于測序的cDNA序列僅限于轉錄本的一端，導致轉錄本中間的重要序列信息丟失。因此，基于標簽的方法主要用于基因表達的量化，不適用于異構體識別或剪接的研究。盡管 Smart-seq和 Smart-seq2 能夠捕獲全長轉錄本，但它們無法利用barcode或 UMI 來對轉錄本進行標記，這就使得它們與高通量并行的單細胞測序不兼容。此外，如果沒有 UMI 標簽，這些方法也就無法解決PCR帶來的擴增偏好性問題。然而，Smart-seq3 通過使用一種特殊的TSO引物克服了全長轉錄本覆蓋和UMI不兼容的限制。

Smart-seq-total被設計出來是為了針對之前的 Smart-seq技術只能捕獲 poly(A)+ RNA 分子的限制 ( Isakova等，2021 )。這種方法的主要進步在于利用大腸桿菌 poly(A)聚合酶在 RNA 分子的 3′端添加腺嘌呤尾巴。因此，所有 poly(A)+ RNA在進行逆轉錄時使用的poly(T)引物都包含UMI和TSO。這種修改使 Smart-seq-total 能夠同時捕獲多種形式的RNA，包括單個細胞內的蛋白質編碼RNA、長非編碼RNA、microRNA 和其他非編碼RNA轉錄本。這種方法有助于探索細胞內編碼和非編碼轉錄本之間的調控聯(lián)系，從而深入了解復雜的調控景觀。但值得注意的是，Smart-seq-total確實也存在一些局限性。首先，它不能評估環(huán)狀RNA。其次，它會導致轉錄本內源性多聚腺苷酸化狀態(tài)的喪失。盡管存在這些缺點，Smart-seq-total 仍然表現(xiàn)出巨大的潛力，可以揭示控制細胞功能的非編碼調控模式，并有助于確定細胞身份。

（4）CEL-seq
CEL-seq(Cell expression by linear amplification and sequencing)是把IVT 中的線性的鏈特異性用于擴增單細胞中的 RNA 的開創(chuàng)性方法 ( Hashimshony 等，2012 )。該過程的起始包括使用具有錨定 poly(T)、特定barcode、5′Illumina 測序接頭和 T7 啟動子的引物合成cDNA的第一鏈。隨后生成第二條鏈，產生含有 T7 啟動子的雙鏈cDNA。來自多個細胞的混合cDNA樣本由T7啟動子起始IVT，從而實現(xiàn) cDNA 的線性擴增，得到擴增后的RNA隨后轉化為cDNA 進行測序。通過線性擴增，CEL-seq最大限度地減少了擴增偏差，與Smart-seq等全長 cDNA 覆蓋技術相比，可提供更靈敏、更可重復的結果。然而，CEL-seq也有局限性，例如無法檢測 miRNA 和其他 poly(A)−轉錄本，并且由于其強烈的 3′偏差而難以區(qū)分不同的可變剪接形式。

CEL-seq2 是 CEL-seq的改進版本，它提高了靈敏度、降低了成本并減少了動手時間（Hashimshony 等人，2016）。為了減輕mRNA分子計數(shù)的偏差，CEL-seq2 在barcode上游引入了 5 個堿基對的 UMI。使用 SuperScript II 雙鏈 cDNA 合成試劑盒并改變CEL-seq引物長度，逆轉錄反應效率顯著提高。CEL-seq2優(yōu)于原始 CEL-seq方法，每個細胞可檢測到兩倍多的轉錄本，檢測到的基因數(shù)增加30%。但值得注意的是，盡管 CEL-seq2 具有明顯的3′偏向性，但是大多數(shù)剪接事件的信息它都不能提供。盡管如此，其更高的靈敏度和單個轉錄本計數(shù)能力使其再轉錄組學中的各種應用具有更多的優(yōu)勢。

（5）SUPeR-seq
SUPeR-seq（single-cell universal poly(A)-independent RNA sequencing）使用具有固定錨序列的隨機引物代替 cDNA 合成中常用的 oligo-dT 引物，這使得檢測單個細胞內的poly(A)+ 和 poly(A)− RNA成為了可能（Fan等，2015b）。該過程涉及利用具有固定錨定序列的隨機引物（AnchorX-T15N6）將總 RNA 逆轉錄為cDNA第一條鏈。在合成初始的cDNA鏈后，用ExoSAP-IT 消化多余的引物，防止形成引物二聚體復合物。使用末端脫氧核苷酸轉移酶和含有1% ddATP 的 dATP將 poly(A)尾巴附加到初始 cDNA 鏈的 3′端，隨后，使用具有可變錨定序列的 poly(T)引物（AnchorY-T24）生成cDNA的第二條鏈。上述兩條鏈使用 AnchorY-T24 和 AnchorX-T15 引物通過 PCR 擴增并進行測序。SUPeR-seq已被用于研究哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中 circRNA 的調控機制。然而，由于缺乏UMI和細胞barcode，它給高通量測序和分子計數(shù)帶來了挑戰(zhàn)。

（6）MATQ-seq
2017年，Sheng 等人（2017）介紹了基于多重退火和加dC尾的定量單細胞 RNA 測序（MATQ-seq）方法。有別于SUPeR-seq，該技術結合barcode和UMI對polyA+和polyA − RNA進行測序。該過程包括使用為多重退火和基于環(huán)狀的擴增循環(huán)（MALBAC）設計的引物將總RNA轉化cDNA第一條鏈。這些引物主要包含G、A和T堿基，以及MALBAC-dT引物。逆轉錄后，cDNA一鏈進行dC加尾，然后使用G富集的MALBAC引物合成cDNA二鏈。UMI在第二鏈合成過程中添加。與 Smart-seq2和SUPeR-seq不同的是，MATQ-seq利用UMI 顯著減少了HEK293T 轉錄本中的前導端或尾端偏差。此外，MATQ-seq在捕獲 polyA − RNA 方面表現(xiàn)出比 Smart-seq2 和 SUPeR-seq更高的靈敏度，捕獲效率為 89.2%±13.2%。這一改進提高了檢測低豐度基因的效率。MATQ-seq的高準確度和靈敏度可以檢測到同一類細胞中各個細胞之間基因表達的細微差異。然而，與 SUPeR-seq類似，MATQ依靠口吸管進行單細胞分離的方法十分耗時，限制了 MATQ-seq的通量。

（7）FLASH-seq
FLASH-seq是一種快速且透徹的全長 scRNA 測序方法，由Hahaut 等人（2022）開發(fā)。為了提高 Smart-seq2方法的效率，該技術進行了幾個關鍵的修改：(i)將逆轉錄和 cDNA 預擴增結合起來，簡化了流程；(ii)用更高效的逆轉錄酶 Superscript IV取代了Superscript II，縮短了逆轉錄反應時間；(iii)增加了dCTP的量，有利于Superscript IV 的 C 尾活性并增強模板轉換反應；(iv)將模板轉換寡核苷酸中的 3′-末端鎖核酸鳥嘌呤替換為核糖鳥苷；(v)將反應體積減少到 5 μL ( Hahaut等，2022 )。這些改動共同導致時間和成本大幅降低。FLASH-seq可以在大約 4.5 小時內完成，比 Smartseq2 等其他方法快2–3.5 小時。與 Smart-seq3 相比，它的單個細胞成本低于其他商業(yè)化和非商業(yè)化的方法，不到 1 美元。此外，F(xiàn)LASH-seq可以檢測到大量的 SNP。該方法適合于尋求經濟實惠、自動化友好、穩(wěn)定且高效的單細胞轉錄分析方法的研究人員。

高通量scRNA-seq技術
(1) 開發(fā)高通量 scRNA-seq的策略
ScRNA-seq的早期階段使用顯微操作器或 LCM 分離單個細胞，進行單獨的轉錄組擴增和文庫構建。然而，這些方法有局限性，因為它們在一次實驗中只能分析幾個細胞。細胞特異性barcode的引入徹底改變了該領域，允許將數(shù)千個單細胞轉錄組混合在一起，在單次運行中進行文庫構建和測序，從而實現(xiàn)高通量并行測序。該方向上的一個顯著進步是 MARS-seq方法的開發(fā)，該方法將 FACS 與自動液體處理相結合，在一次實驗中成功測序數(shù)千個細胞（Jaitin 等人，2014）。該方法采用三種不同水平上的標識用于標記細胞、培養(yǎng)板和mRNA，便于混合所有材料進行后續(xù)自動化處理。與 MARS-seq類似，STRT-Seq-2i 旨在通過實施專門的 FACS 和barcode流程來提高測序通量（Hochgerner 等人，2017）。該方法使用定制的鋁板，該鋁板上有 9,600 個孔，排列成 96 個子陣列，每個子陣列有 100 個孔，一次運行即可同時對 9,600 個細胞進行測序。然而，盡管這些基于培養(yǎng)板的方法提高了通量，但可分析的細胞數(shù)量仍然有限。微流控技術的引入從根本上解決了高通量單細胞操作帶來的挑戰(zhàn)。2012，F(xiàn)luidigm C1 系統(tǒng)成為首個商用自動化微流控平臺，可同時對 96 個單細胞進行自動細胞分離、細胞裂解、cDNA 合成、擴增和文庫制備。但該系統(tǒng)的處理能力有限，無法滿足高通量并行測序的需求。2015年，基于液滴的微流控 scRNA-seq技術的出現(xiàn)帶來了革命性的突破。以Klein 等人和Macosko 等人開發(fā)的方法為例，這類方法能夠同時處理數(shù)千個細胞（Klein等，2015 ; Macosko等，2015）。這項重大進步使單細胞基因組學領域真正大規(guī)模并行測序成為可能。隨后，其他高通量并行測序策略也被開發(fā)出來，包括 sci-RNA-seq（Cao等，2017）和 SPLiT-seq（Rosenberg等，2018）。這些方法采用組合式索引方法來標記細胞，而無需對單個細胞進行物理分隔。這些技術具有很高的細胞標記效率，操作簡單，并可大幅降低測序成本。我們將在下文詳細討論這些創(chuàng)新技術。

（2）基于微孔板的高通量 scRNA-seq方法
基于微孔板的高通量 scRNA-seq方法包括通過 FACS 將細胞分選到微孔板上，并標記細胞轉錄本以進行后續(xù)高通量測序。這些方法的優(yōu)勢在于可以處理任意數(shù)量的單個細胞，而不會顯著影響每個細胞的成本。另一方面，其他高通量方法，例如基于液滴的技術，如 Drop-seq（Macosko等，2015）、InDrop（Klein等，2015）和 10x Chromium（Zheng等，2017），在同時分析大量細胞時能夠分攤成本，使成本的效益更高。基于孔板的方法的測序通量受所用微孔板數(shù)量的限制。接下來將詳細討論這些技術。

1）Quartz-seq。為了揭示非遺傳細胞異質性的生物學功能和根本原因，Sasagawa 等人開發(fā)了簡單但定量水平很高的Quartz-seq技術。Quartz-seq通過解決三個關鍵方面提高了全轉錄本擴增的簡單性和定量性能。首先，為了克服以往基于 poly(A)尾反應的全轉錄本擴增技術中副產物過多的問題，Quartz-seq結合了外切酶 I 處理、調控 poly(A)尾以及優(yōu)化的阻抑PCR。這種策略方法完全消除了副產物的合成，簡化了后續(xù)的 scRNA-seq分析。其次，該技術采用了針對單管反應優(yōu)化的強效 DNA 聚合酶 (MightyAmp DNA Polymerase)。這種 PCR 酶的選擇提高了 cDNA 產量，提高了全轉錄本擴增復制的可重復性，并減少了所需的 PCR 循環(huán)次數(shù)。最后，Quartz-seq通過調節(jié)退火溫度來優(yōu)化 RT 和第二鏈合成的效率。值得注意的是，該方法的所有步驟都合并到一個 PCR 管中，無需純化，每個單細胞僅涉及六個反應步驟。這種精簡大大簡化了 Quartzseq方法，有助于其高通量實施。除了簡單之外，Quartz-seq還表現(xiàn)出很高的定量準確性、可重復性和靈敏度。因此，它可以辨別各種類型的非遺傳細胞異質性，并區(qū)分不同細胞類型和同一細胞類型內的細胞周期階段。

Quartz-seq2 ( Sasagawa等，2018 )是一種創(chuàng)新的高通量 scRNA-seq方法，是作為 Quartz-seq的擴展而開發(fā)的。該方法包括使用 FACS 將單個細胞分選到 384 孔板中，然后使用結合了 oligo-dT 序列、細胞barcode序列和 UMI 序列的引物進行 RT。通過應用多個分子生物學階段的進步，包括對 poly(A)標記的重大升級，Quartz-seq2 實現(xiàn)了出色的 UMI 轉換效率。值得注意的是，Quartz-seq2采用了基于T55緩沖液和遞增溫度條件組合的poly(A)標記策略，使cDNA的數(shù)量增加了約3.6倍。

Quartz-seq2的UMI轉換效率非常高，從32%到35%不等，超過了CEL-seq2、SCRB-seq和MARS-seq（7%-22%）等其他方法。由于效率的提高， Quartz -seq2可以從更少的序列讀取中以更低的成本識別出更多的轉錄本。與MARSseq類似，Quartz-seq2使用FACS進行細胞分選，這一過程需要熟練的工人。盡管有這個要求，但該技術更高的UMI轉換效率和成本效益使其成為scRNA-seq應用的一種有價值方法。

2）MARS-seq。MARS-seq是一種自動化、高度并行的RNA單細胞測序技術，開發(fā)于 2014（Jaitin等，2014），通過在 oligo-dT 引物中引入UMI實現(xiàn)對唯一RNA分子的計數(shù)，從而徹底改變了這一領域。MARS-seq流程使用 FACS 將單細胞分選到384 孔板中。逆轉錄和文庫構建過程遵循 CEL-seq流程，確保方法具有系統(tǒng)性和可重復性。MARS-seq的關鍵創(chuàng)新之一在于其自動化，該方法的每一步都由液體處理機器人執(zhí)行。這種自動化提高了該技術的可重復性，并顯著提高了通量。MARS-seq的高通量和自動化特性使其適用于正常和疾病狀態(tài)下的各種組織和器官。通過描述組織的細胞類型和細胞狀態(tài)組成，MARS-seq有助于全面了解這些生物實體，并將這些信息與詳細的全基因組轉錄譜聯(lián)系起來。

2019，研究團隊在 MARS-seq方法的基礎上，開發(fā)了用于索引排序和大規(guī)模并行單細胞 RNA 測序的集成流程 (MARS-seq2.0)（Keren-Shaul等，2019）。MARS-seq2.0 能夠在一次運行中高效測序 8,000–10,000 個細胞，顯著提高了通量。值得注意的是，該方法將逆轉錄反應的體積減少了八倍，從 4 μ L 減少到 500 nL。由于體積減少，制備單細胞文庫的成本將下降六倍。MARS-seq2.0 是一種基于 3′的 scRNA-seq技術，這限制了它在確定基因 5′端的可變剪接異構體或特定序列方面的應用。這是需要記住的關鍵一點。盡管存在這一限制，MARS-seq2.0 中索引式 FACS 分類與 scRNAseq的整合已被證明有利于識別稀有亞群和處理人類臨床樣本中的稀有細胞。此外，MARS-seq2.0 提供了一個靈活的平臺，通過將無偏轉錄圖譜與大量熒光標記相結合，能夠同時獲得同一單細胞的多層信息，涵蓋遺傳學、信號傳導、表觀遺傳學和空間定位。這種多方面的方法有助于更深入地從分子層面理解生理過程和疾病。

3）SCRB-seq。為了降低探究異質性細胞群中基因表達變異的主要模式的成本， Soumillon 等人基于 Smart-seq方案開發(fā)了SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing），使用最少的試劑和最少的單個細胞測序讀數(shù)來分析大量細胞中的mRNA。SCRB-seq利用FACS將單個細胞分選到 384 孔板中。Poly(A)+ mRNA 通過 RT 轉化為 cDNA，逆轉錄使用模板轉換逆轉錄酶和由barcode、UMI 和 poly(T)引物組成的逆轉錄引物。此后，鏈信息被保留下來，來自多個細胞的被修飾過的cDNA混合在一起進行擴增，用改進的基于轉座子的片段化技術進行測序，該技術富集 3′端。SCRB-seq技術能夠測序大約 12,000 個單細胞，提供深度和全長轉錄組覆蓋測序。此外，它所需的酶反應、純化和液體轉移步驟比 MARSseq方法少大約兩倍 ( Jaitin等，2014 )。與 Smartseq相比，SCRB-seq在逆轉錄期間添加了獨特的細胞barcode，從而更容易識別來自同一細胞的讀取并提高測序通量。盡管如此，對大量單細胞進行測序仍然面臨挑戰(zhàn)。

4）STRT-seq-2i。STRT -seq-2i 是一種雙索引 5′單細胞和細胞核 RNA 測序方法，旨在顯著提高通量 ( Hochgerner等，2017 )。它使用專門設計的 9,600 微孔板，有助于提高效率。微孔陣列可以對單細胞孔進行成像驗證，減少單孔中雙聯(lián)體的出現(xiàn)。除了保留了一些優(yōu)點，例如可顯示轉錄起始位點的 5′端reads、添加 UMI 進行絕對定量，以及使用單端測序而非雙端測序以最大限度提高成本效率之外，STRT-seq-2i 仍然與之前描述的 STRT-seq方法兼容。該技術已證明其可適應各種實驗環(huán)境，因為它可用于檢查新鮮單個小鼠皮質細胞和冷凍的死后人類皮質細胞核的轉錄譜。

（3）基于微流體的高通量 scRNA-seq方法
基于液滴和微孔的平臺是高通量 scRNA-seq的主要技術能夠在一次實驗中分析大約 10,000 個單細胞的轉錄組。這兩種方法基本上都涉及將單個細胞分離到許多納升大小的容器（例如微孔或油包水液滴）中，其中包含逆轉錄所需的化學物質。與非微流體方法和帶有閥門的微流體方法相比，將細胞barcode集成到這些微流體平臺中的策略可顯著提高通量，同時降低成本。這一進步對于需要對大量細胞進行全面轉錄組分析的生物醫(yī)學研究應用尤其有利。

1）基于液滴的 scRNA-seq技術。（i）InDrop。inDrop 的基本技術（Klein 等人，2015）是將單個細胞包裹在含有裂解緩沖液、逆轉錄試劑和barcode水凝膠微球 (BHM)的液滴中。每個 BHM 包含 ~109個可以光解的標簽引物（147,456 個不同的標簽）。該技術中采用的微流體裝置包含用于載體油、細胞、裂解/逆轉錄試劑和 BHM 的入口，以及用于液滴收集的出口。每個 BHM 都通過光釋放鍵共價連接到標簽引物，這些引物具有 T7 RNA 聚合酶啟動子、Illumina 測序接頭、獨特細胞barcode、UMI 和 poly(T)尾。樣本中的所有 BHM 共享相同的細胞barcode以區(qū)分樣本，但擁有不同的 UMI 以進行精確的轉錄計數(shù)。封裝后，紫外線 (UV)暴露使引物釋放并結合mRNA ，在 cDNA 合成過程中進行barcode編碼，同時使反應仍限制在同一液滴中。隨后，按照 CEL-seq方案（Hashimshony 等，2012），在液滴破裂后匯集所有細胞的 cDNA 以進行文庫構建和測序。與傳統(tǒng)方法不同，InDrop固有的可擴展性不受反應室數(shù)量的限制。此外，通過在液滴內進行裂解和逆轉錄簡化了操作過程。然而，inDrop 的一個顯著缺點是其相對較低的 mRNA 捕獲效率（~7%），這使得轉錄本豐度低于 20–50 個轉錄本的基因在單細胞中難以可靠地檢測到。

（ii）Drop-seq。與inDrop 類似，Drop-seq旨在對數(shù)千個單細胞中的 mRNA 表達進行高通量分析。它通過將每個細胞與帶有唯一標記的珠子共同封裝在納升級的油包水液滴中以同時處理來實現(xiàn)這一點（Macosko等，2015）。與使用標記水凝膠微球的 inDrop 不同，Drop-seq使用由不變的硬樹脂制成的珠子。這些樹脂珠直接用標記引物合成，其中包括用于捕獲 mRNA 的 poly(T)序列、細胞barcode、UMI 和用于擴增的通用PCR序列。每個珠子含有超過 108種不同的引物。細胞在液滴中裂解后，釋放的 mRNA 與伴隨珠子上引物的poly(T)尾巴雜交，生成固定在微粒上的單細胞轉錄組 (STAMP)。液滴破裂后，數(shù)千個 STAMP 匯集在一起，在一次反應中進行逆轉錄、PCR 擴增和測序。與 inDrop (147,456)相比，Drop-seq方法擁有更多獨特的barcode (16,777,216)，從而能夠實現(xiàn)經濟高效且快速的高通量分析。

（iii）10x Genomics。10x Genomics 系統(tǒng) ( Zheng等，2017 )是一個完全商業(yè)化的平臺，與 inDrop 和 Drop-seq有相似之處。反應體系中的凝膠珠 (GEM)是該方法的基本組成部分。創(chuàng)建 GEM需要使用 8 通道微流體裝置，該芯片在6分鐘內可以生成 100,000 個 GEM，每個 GEM 可容納數(shù)千個細胞。GEM 中的每個凝膠珠都含有標簽寡核苷酸，包括 Illumina 接頭、10x barcode、UMI 和 poly(T)尾巴，使得poly(A)+ RNA能夠逆轉錄。細胞與凝膠珠共封裝成液滴后，細胞立即裂解，釋放出mRNA。隨后，凝膠珠溶解并釋放帶標簽的寡核苷酸，從而實現(xiàn)poly(A)+RNA的RT。RT反應在每個液滴內進行，產生的cDNA分子具有每個GEM共享的barcode、唯一的UMI，并在3′端以TSO結尾。去除油相后，帶標簽的cDNA混合起來，遵循Smart-seq流程進行PCR擴增。

InDrop、Drop-seq和Chromium是三個類似的平臺，它們采用液滴微流控方法分離單細胞以進行高通量測序。這三種方法每天都可以快速處理數(shù)萬個細胞。這三種技術在以下四個方面有所不同：

首先，inDrop和10x Genomics使用的是水凝膠微球，而Drop-seq中使用的珠子是硬樹脂。inDrop 和 10x Genomics 使用的水凝膠珠子較柔軟，封裝在微流控通道中時可以同步產生超泊松分布。對于單個細胞和珠子在同一個液滴中的封裝，雙泊松分布控制著微小硬珠子的封裝。因此，inDrop 和 10x Genomics 可以獲得比 Drop-seq更高得多的細胞捕獲效率。據(jù)報道，10x Genomics 的細胞捕獲率約為 50%（Zheng等，2017）。

其次，inDrop 和 10x Genomics 使用水凝膠珠子，可以將引物固定在珠子內部，而 Drop-seq的引物只能固定在更小的硬珠表面。封裝后，inDrop 利用紫外線誘導的裂解來釋放引物。10x Genomics通過直接溶解珠子將引物全部釋放到溶液中，提高了mRNA的捕獲效率，而Drop-seq的引物不能從珠子中釋放出來，mRNA分子會與珠子上的poly(T)尾雜交形成STAMP進行RT，這是Drop-seq相較于inDrop和10x Genomics的一個缺點。再次，Drop-seq在mRNA與引物雜交后立即分裂液滴，將所有STAMP混合在一起進行RT，而inDrop和10x Genomics方法將RT試劑共封裝在液滴中，每個液滴內獨立進行RT反應，有利于提高cDNA轉化的特異性，提高相對產量，減少試劑消耗（Streets等，2014）。

最后，三個平臺采用了不同的建庫策略。Drop-seq和 10x Genomics 使用類似于眾所周知的 Smart-seq化學的模板切換程序，而 inDrop 使用 CEL-seq方法。因此，它們分別繼承了 Smart-seq和 CEL-seq的優(yōu)點和缺點。

（iv）MULTI-seq。為了在逆轉錄期間傳遞細胞特異性barcode，之前討論的所有基于液滴的技術通常都使用共封裝策略，這需要同時封裝細胞和barcode珠子。MULTI-seq方法（使用脂質標記進行單細胞和單核 RNA的樣本多重測序）最近由McGinnis 等人 (2019b)引入，作為一種以獨特方式使用細胞barcode的替代策略。在這項技術中，DNA barcode通過與“錨”脂質修飾寡核苷酸 (LMO)雜交而被標記到單細胞的質膜上。“錨定” LMO 的疏水性 5 '二十六酸酰胺與膜結合；與帶有 3 '棕櫚酸酰胺的“共錨定” LMO 雜交可增強復合物的疏水性，延長膜保留時間。3'poly(A)捕獲序列、8 bp 樣本barcode和 5'PCR 手柄組成 LMO。LMO 攜帶的每個單細胞或細胞核與 mRNA 捕獲珠共同封裝到由 10x Genomics 系統(tǒng)生成的乳液液滴中。樣本解復用是通過在液滴內細胞裂解時釋放內源性 mRNA 和 LMO 實現(xiàn)的，它們在逆轉錄期間都與 mRNA 捕獲珠雜交并附著到通用細胞barcode上。內源性 mRNA 和 LMO 在擴增后通過大小選擇分離，從而實現(xiàn)以用戶定義的比例進行匯集測序。使用此方法可以對任何具有可及質膜的物種的任何細胞類型或細胞核進行barcode編碼。此外，這種方法涉及的樣品處理最少，從而保留了細胞活力和內源基因表達模式。

2）基于微孔的 scRNA 測序方法。（i）CytoSeq。Cytoseq是一種高度可擴展的 scRNA 測序方法，可同時分析幾千個細胞，并可輕松擴展到 10,000 或 100,000 個細胞，每個細胞可檢測大約 100 個基因（Fan等，2015a）。該方法采用遞歸泊松策略來調整懸浮液中的細胞數(shù)量，促進細胞在重力作用下高通量沉降在 100,000 個微孔中的 1/10 中。由于反應中使用的體積為納升，因此文庫制備成本極低。此外，Cytoseq的優(yōu)勢在于它不受特定細胞大小和形狀的限制，可以研究大量異質細胞群的表達譜。這種靈活性允許在大量背景群體中檢測稀有細胞類型。

（ii）Seq-Well。Seq-Well 是一種便攜、經濟高效、用戶友好且高效的 scRNA-seq方法，專為低輸入樣本而設計（Gierahn等，2017）。該方法利用皮孔陣列，其中裝有barcode mRNA 捕獲珠和細胞，每個孔可容納一個細胞和近一個珠子。細胞在重力作用下沉入孔中后，半透膜會密封陣列，為每個孔創(chuàng)建獨特的環(huán)境，允許緩沖液交換但防止大分子遷移。隨后，細胞被裂解，并進行擴增和測序過程。Seq-Well 板有大約 86,000 個亞納升孔，可以同時分析來自不同來源的數(shù)千個細胞中的轉錄組。該方法特別適合于低樣本輸入，例如組織夾、細針抽吸物以及難以研究的細胞，如肝細胞和粒細胞（Kumar，2021）。值得注意的是，Seq-Well的實現(xiàn)只需要一個皮孔陣列、一個移液器、一個聚碳酸酯膜、一個烤箱或熱源、一個夾具和一個管旋轉器即可生成穩(wěn)定的 cDNA 產物。這種簡單性使其能夠適應資源有限的環(huán)境，例如診所和偏遠地區(qū)（Aicher 等人，2019）。

（iii）ICELL8。ICELL8 是一種基于微孔的微流體系統(tǒng)，通過結合一個包含 5,184 個納米孔的微芯片來提高吞吐量，從而可以捕獲和處理大約 1,300 個單細胞（Goldstein 等人，2017）。每個納米孔均含有預印的寡核苷酸，包括寡核苷酸 (dT 30 )引物、孔特異性barcode序列和 UMI。該過程包括使用多樣品納米分配器 (MSND)將單細胞懸浮液分配到微芯片納米孔中，然后通過凍融循環(huán)裂解細胞。細胞裂解后，進行逆轉錄以合成 cDNA，采用 SCRB-seq方法。最終，將來自數(shù)百個細胞的 cDNA 匯集到一個試管中用于構建文庫。該方法有幾個優(yōu)點：i)使用 MSND 儀器將細胞準確地分配到納米孔中，消除了與手動移液相關的誤差；ii)結合成像軟件來識別含有活單細胞的納米孔，確保只有含有單細胞的孔才會被處理到測序文庫中，從而產生較低的細胞多重率 (<3%); iii)使用多樣本納米分配器在一個陣列上加載多達八種實驗條件的能力，使得在一次實驗中，一塊芯片上 5,184 個納米孔可同時處理 800–1,400 個細胞。

為了提高 ICELL8 的捕獲率，并能夠同時處理超過 5,000 個細胞用于測序文庫， Shomroni 等人 (2022)介紹了一種名為 CellenONE-ICELL8 的新型 scRNA-seq方法。該方法將 ICELL8 處理儀器與 CellenONE 分離和分選系統(tǒng)相結合。CellenONE 依靠基于圖像的單細胞分離，能夠在隨后的樣品處理和測序之前，根據(jù)細胞形態(tài)、大小或熒光標記等參數(shù)選擇高度純化的單個細胞。與單獨的 ICELL8 系統(tǒng)相比，CellenONEICELL8 中兩種儀器的集成顯著提高了細胞捕獲效率，捕獲的細胞數(shù)量從典型的 1,200 到 1,400 個細胞增加到 3,300 多個細胞。此外，該方法利用SMART-seq技術，可以檢測非編碼RNA，特別是較長的基因間非編碼RNA，以及內含子和基因間序列。

（4）基于組合索引的高通量scRNA-seq技術
1）Sci-RNA-seq。Cao等（2017）開發(fā)了第一個用于高通量scRNA-seq的組合索引方法，稱為sci-RNA-seq。這種創(chuàng)新方法有助于分析大量單細胞或細胞核的轉錄組，通過使用雙UMIbarcode提供3′覆蓋和高深度測序。sci-RNA-seq的可擴展性允許在單次實驗中生成約4×104個單個細胞轉錄組，索引規(guī)模高達576×960。這種可擴展性使得通過加入額外輪次的索引或/和使用更多帶barcode的逆轉錄和 PCR 引物能夠以亞線性成本擴展處理更多細胞。但sci-RNA-seq并非沒有缺點，這些缺點包括繁瑣的實驗程序、高通量轉座反應的高成本以及 FACS 分選帶來的明顯細胞損失。

2）SPLiT-seq。SPLiT- seq代表了另一種專為 scRNA-seq分析而設計的創(chuàng)新組合索引方法，可以檢查保存在 1.33% 甲醛中的固定組織（Rosenberg等，2018）。與 sci-RNA-seq不同，SPLiT-seq通過連接將第二輪和第三輪barcode插入 cDNA 中。這種方法提供了更簡單、更溫和、更具成本效益的工作流程。SPLiT-seq的第一輪barcode可以充當樣本標識符，從而實現(xiàn)多重并行的樣本處理。SPLiT-seq特別適合分析臨床相關組織樣本中產生的固定、難以完全解離的細胞或細胞核。然而，應該考慮一些局限性，包括醛基細胞固定可能導致 mRNA 發(fā)生化學修飾、由于復雜的交聯(lián)細胞內環(huán)境導致固定細胞內逆轉錄和連接反應效率不佳以及固定過程中 RNA 質量可能下降，從而導致檢測到的基因水平降低。

單細胞核RNA測序
ScRNA-seq是探索復雜組織中細胞類型、功能過程和動態(tài)狀態(tài)的有力工具。然而，在處理無法輕易分離的存檔樣本或組織時，其應用受到限制，從而阻礙了對新細胞類型或與免疫和疾病相關的關鍵信息的探索。為了解決這一困難，科學家們采用了單細胞核RNA測序 (snRNA-seq)技術，其中 RNA 測序實驗使用細胞核而不是整個細胞作為代理進行。已經開發(fā)了幾種 snRNA-seq方法來分析從冷凍、輕度固定或新鮮組織中獲得的單細胞核RNA，包括 DroNc-Seq（Habib 等人，2017 ）、Div-seq（Habib 等人，2016 ）、snDrop-seq（Lake 等人，2019）。這些方法將轉錄組分析的適用性擴展到更廣泛的樣本類型和樣本處理方式。

由于 snRNA-seq與傳統(tǒng) scRNA-seq方法檢測到的基因之間存在高度相關性，因此 snRNA-seq技術在各個研究領域的使用已被證明很有價值（Fischer and Ayers，2021 ）。這些技術可用于多種樣本類型，例如新鮮組織，如腦 ( Affinati 等人，2021)、心臟 ( Nicin 等人，2021)、腎臟 ( Barwinska 等人，2021；Muto 等人，2021)、胰腺 ( Basile 等人，2021)、肌肉 ( Petrany 等人，2020)或脂肪組織 ( Sun 等人，2020b)、存檔組織 ( Basile 等人，2021)、植物細胞 ( Conde 等人，2021)。盡管有這些優(yōu)勢，但與分離的細胞類型相比，分離的細胞核通常更具粘性。因此，應采取預防措施防止結塊，否則會導致雙峰率膨脹。此外，值得注意的是，某些基因轉錄本可能在 snRNA-seq和 scRNA-seq數(shù)據(jù)集之間表現(xiàn)出富集差異。例如，長鏈非編碼 RNA（lncRNA）在 snRNA-seq數(shù)據(jù)集中富集，而位于細胞質中的線粒體轉錄本僅存在于 scRNA-seq數(shù)據(jù)集中（Fischer and Ayers，2021）。研究人員在選擇單個細胞核進行測序之前，需要仔細評估這些亞定位基因對他們的特定研究項目是否至關重要。

參考文獻
Sun F, Li H, Sun D, et al. Single-cell omics: experimental workflow, data analyses and applications. Sci China LifSun F, Li H, Sun D, et al. Single-cell omics: experimental workflow, data analyses and applications. Sci China Life Sci. 2025;68(1):5-102. doi:10.1007/s11427-023-2561-0e Sci. 2025;68(1):5-102. doi:10.1007/s11427-023-2561-0