期刊：Science China-Life Sciences
影響因子：8.0

scRNA-seq 的原始數(shù)據(jù)格式和目前大多數(shù)scRNA-seq 分析過程都基于 FASTQ 文件（或壓縮格式 fq.gz）。Illumina 平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)默認(rèn)生成 BCL 格式文件，可以通過 CellRanger mkfastq 進(jìn)行轉(zhuǎn)換。scRNAseq的分析流程包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、處理和擴(kuò)展下游分析（圖4），其中數(shù)據(jù)預(yù)處理包括質(zhì)控、read比對(duì)和表達(dá)量化；數(shù)據(jù)處理包括標(biāo)準(zhǔn)化、批次效應(yīng)校正、歸一化、特征選擇（HVG選擇）、降維與聚類、細(xì)胞分型注釋、差異表達(dá)分析（DEGs）、可視化；擴(kuò)展下游分析包括擬時(shí)序、細(xì)胞間相互作用（CCI）、通路富集分析、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）等下游分析。整體來看，scRNAseq分析方法層出不窮，沒有絕對(duì)完美適用于所有場(chǎng)景的方法，分析工具重要的是獲取生物學(xué)信息，難點(diǎn)在于選擇最合適的方法。本文中，我們將提出總結(jié)常見的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法，并對(duì)其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍提出建議。

圖4：?jiǎn)渭?xì)胞分析概覽。A. 在預(yù)處理階段，基于測(cè)序數(shù)據(jù)，細(xì)胞-基因矩陣讀數(shù)通過單細(xì)胞讀數(shù)校正和定量產(chǎn)生；B. 分析使用的高質(zhì)量細(xì)胞矩陣通過原始的基因表達(dá)矩陣獲得，通過去批次效應(yīng)矯正批次，通過標(biāo)準(zhǔn)化降低生物學(xué)差異，補(bǔ)充未檢測(cè)到的基因；C. 依照或不依照先前的參考信息對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行注釋；D. 轉(zhuǎn)錄組特征相似的細(xì)胞被歸為一類，稱為“細(xì)胞簇（cluster）”，細(xì)胞的可視化通過降維方法實(shí)現(xiàn)，差異基因分析對(duì)組間差異進(jìn)行檢驗(yàn)；E. 擬時(shí)序分析重建細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平變化的動(dòng)力學(xué)過程；F. 細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄組調(diào)控關(guān)系可以通過胞間互作分析進(jìn)行推斷。

數(shù)據(jù)預(yù)處理
將原始測(cè)序數(shù)據(jù)通過濾除低質(zhì)量reads和環(huán)境干擾與參考基因組進(jìn)行比對(duì)和量化。從而得到每個(gè)細(xì)胞的特征計(jì)數(shù)矩陣和記錄其他信息的輔助文件，用于下游的數(shù)據(jù)分析（圖4 A）。

（1）質(zhì)控
由于測(cè)序儀器問題、人為操作、細(xì)胞自發(fā)情況，或存在空液滴、雙細(xì)胞、死細(xì)胞等，不可避免地會(huì)產(chǎn)生低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)（Chen等，2019a ; Hao等，2021b）。空液滴通常出現(xiàn)在液滴捕獲細(xì)胞外背景轉(zhuǎn)錄本而不是細(xì)胞時(shí)（Ilicic等，2016 ; Kolodziejczyk等，2015）。一種高度主觀的方法是根據(jù)曲線的膝點(diǎn)確定一個(gè)UMI閾值，并過濾掉UMI計(jì)數(shù)低的細(xì)胞。隨后使用DropEst ( Petukhov等，2018 )、EmptyDrops ( Lun等，2019 )和 DIEM ( Alvarez等，2020 )增強(qiáng)過濾效果。DropletQC ( Muskovic and Powell, 2021 )量化未剪接前 mRNA 含量的核分?jǐn)?shù)得分。MT 基因閾值雖然是衡量死細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，但它的選擇需要綜合考慮細(xì)胞生理因素 ( Subramanian等，2022 )。近年來，基于深度學(xué)習(xí)的方法也應(yīng)運(yùn)而生，例如基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的 EmptyNN ( Yan等，2021 )和基于深度生成模型的 CellBender ( Fleming等，2019 )，能夠有效識(shí)別空液滴中的背景轉(zhuǎn)錄本。

雙細(xì)胞是指兩個(gè)細(xì)胞包含在一個(gè)液滴中的情況，根據(jù)轉(zhuǎn)錄分布可分為同源雙峰和異源雙峰，均服從泊松統(tǒng)計(jì)量（Bloom, 2018）。絕大多數(shù)方法基于基因表達(dá)計(jì)算，利用先驗(yàn)知識(shí)或深度學(xué)習(xí)獲取單峰與雙峰細(xì)胞的差異，然后訓(xùn)練分類器進(jìn)行篩選，例如基于最近鄰的 DoubletFinder ( McGinnis等，2019a )、Scrublet ( Wolock等，2019 )；基于反卷積的 DoubletDecon ( DePasquale等，2019 )、基于變分自編碼器的 Solo ( Bernstein等，2020 )和基于集成算法的 Chord ( Xiong等，2021a )。此外，Scds 是另一種篩選方法，它依賴于基于共表達(dá)的雙聯(lián)體打分和基于二分類的雙聯(lián)體打分策略，實(shí)現(xiàn) scRNA-seq 表達(dá)數(shù)據(jù)的雙聯(lián)體分離 (Bais and Kostka，2020)。一些方法使用其他特征，例如 demuxlet 它使用自然遺傳變異信息指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)并通過計(jì)算進(jìn)行過濾 ( Kang等，2018 )。

合理的質(zhì)控需要綜合考慮技術(shù)性和生物性因素，這也是當(dāng)前研究的主要方向。最近一種由生物數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的自學(xué)習(xí)無監(jiān)督質(zhì)控方法 ddqc被提出來，用于確定各種 GC 指標(biāo)的具體閾值 ( Macnair and Robinson，2023 )。

（2）reads比對(duì)和定量
質(zhì)控后剩余的高質(zhì)量細(xì)胞需要將這些短reads映射到特定的參考基因組上進(jìn)行比對(duì)，以此對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。RNA比對(duì)通常分為兩步：比對(duì)reads以建立索引和映射RNA剪接序列，前一步與DNA reads比對(duì)共用，解決錯(cuò)配問題并設(shè)置索引參考；后一步是RNA reads比對(duì)所特有的，提供連通性信息。

早期二代測(cè)序結(jié)果是幾十對(duì)長(zhǎng)度的堿基reads。Seed-to-extend ( Buhler，2001 )（包括MAQ ( Li等，2008a )、SOAP ( Li等，2008b )、CloudBurst ( Schatz，2009 )、ZOOM ( Lin等，2008 )）、BurrowsWheeler 變換方法 ( Burrows and Wheeler，1994 )（包括SOAP2 ( Li等，2009 )、Bowtie ( Langmead等，2009 )、BWA ( Li and Durbin，2009 )）、Needleman-Wunsch 方法（包括Novocraft ( Hercus，2009 )）和suffix-tree算法方法（包括MUMmer 2 ( Delcher等，2002 )）都是百萬級(jí)短鏈 DNA 測(cè)序reads比對(duì)的有效工具。Bowtie采用了一種依賴于Burrows-Wheeler Transforming的FM-index方法，如果reads有多個(gè)準(zhǔn)確匹配則結(jié)果只報(bào)告一個(gè)，與MAQ（Ferragina and Manzini， 2001）相比，大大優(yōu)化了運(yùn)行內(nèi)存和比對(duì)速度。BWA是另一種基于BWT的比對(duì)方法，使用新的SAM（Sequence Alignment/Map）格式輸出比對(duì)結(jié)果。基于MAQ和Bowtie兩種短鏈DNA比對(duì)算法，Cole Trapnell于2009年提出了第一個(gè)針對(duì)NGS數(shù)據(jù)的RNA-seq比對(duì)方法TopHat，它使用2-bit-per-base編碼實(shí)現(xiàn)reads與哺乳動(dòng)物基因組中剪接位點(diǎn)的有效比對(duì)，而無需事先知道剪接位點(diǎn)的具體信息（Trapnell等， 2009）。

上述方法在堿基對(duì)長(zhǎng)度超過50 bp時(shí)比對(duì)精度急劇下降（Gupta等，2018 ; Lebrigand等，2020）。NGS單細(xì)胞測(cè)序分析主要采用兩類方法：基于Bowtie2的方法和基于seed策略的方法（Langmead and Salzberg, 2012）。Bowtie2是Bowtie的升級(jí)版，保留了FM-index依賴的BWT算法核心，允許有間隙比對(duì)，并使用單指令多數(shù)據(jù)（SIMD）擴(kuò)展到長(zhǎng)測(cè)序比對(duì)，同時(shí)提高運(yùn)行速度。Daehwan Kim在Bowtie2基礎(chǔ)上，先后提出了TopHat2（Kim等，2013）和HISAT（Kim等，2015）。種子策略主要有STAR（Dobin等，2013）和Subread（Liao等，2013）。STAR基于最大可映射前綴（MMP）的思想，采用順序檢索的策略，將與參考匹配的最長(zhǎng)部分reads設(shè)為種子1，其余read繼續(xù)匹配，依次從種子2調(diào)用至種子n 。值得注意的是，Rsubread完全基于R語言平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了第一次read比對(duì)和基因量化的過程（Liao等，2019）。

基因表達(dá)量化又可分為偽比對(duì)量化和基于read比對(duì)的量化。偽比對(duì)是指不采用上述嚴(yán)格的兩步法將所有reads比對(duì)到參考基因組上，包括選定的 k-mers 比對(duì)方法（Sailfish（Patro等，2014）、Kallisto（Bray等，2016）、Salmon（Patro等，2017）、RapMap（Srivastava等，2016））和 Barcode-UMI-Set (BUS)比對(duì)方法 BUStools（Melsted等，2019）。Kallisto-BUStools 是最新的工作流程，它使用 BUS 文件格式進(jìn)行初始數(shù)據(jù)預(yù)處理，與 BUStools 一樣，偽比對(duì)結(jié)果和量化計(jì)數(shù)都保存在 BUS 文件中（Melsted等，2021）。另一方面，基于reads比對(duì)的方法依賴于 RNA reads比對(duì)方法的結(jié)果來量化基因。CellRanger 是10x Genomic 公司指定替代 Longranger 的官方開源數(shù)據(jù)預(yù)處理軟件（Zheng等，2017）。STARsolo 是替代 Cellranger 的mapping/quantification 功能的工具，可實(shí)現(xiàn)多平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析和基因表達(dá)之外的轉(zhuǎn)錄組特征的量化（Kaminow等，2021）。其他基于reads比對(duì)的基因表達(dá)定量方法如 UMItools ( Smith等，2017 )、zUMIs ( Parekh等，2018 )、Alevin-fry ( He等，2022 )、DropEst ( Petukhov等，2018 )、RainDrop ( Niebler等，2020 )、baredSC ( Lopez-Delisle and Delisle, 2022 )、BCseq ( Chen and Zheng, 2018 )使用各種質(zhì)量過濾器和 barcode/UMI 處理策略在一定程度上提高了 CellRanger 的性能。

CellRanger 和 STARsolo 在處理包括 10x Chromium 在內(nèi)的各種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集時(shí)都具有良好的運(yùn)行速度，并且準(zhǔn)確度極高。但在獲得幾乎相同結(jié)果的前提下，后者相比前者提升了至少5倍的運(yùn)行速度，這也驗(yàn)證了Alexander Dobin等人使用STARsolo取代CellRanger的目的（Brüning等，2022 ; Chen等，2021a ; You等，2021）。

數(shù)據(jù)處理
在對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行必要的調(diào)整（Normalization、Batch Effect Correction、Imputation）后，即可從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中充分挖掘出生物信息進(jìn)行分析。Seurat和Scanpy分別基于R和Python對(duì)上述過程進(jìn)行模塊化、可擴(kuò)展的處理，是目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的主流分析流程（Satija等，2015 ; Wolf等，2018）。常規(guī)分析流程和預(yù)期處理結(jié)果可參見總分析框架（圖4 B-D）。

（1）標(biāo)準(zhǔn)化
在測(cè)序過程中，技術(shù)原因或者細(xì)胞本身的生物學(xué)差異可能造成同一樣本內(nèi)（細(xì)胞之間）或者不同樣本之間的文庫大小差異（Marinov等，2014）。無限數(shù)方法按照文庫大小進(jìn)行處理，按照具體原理大致可以分為基于全局縮放的標(biāo)準(zhǔn)化、spike-in標(biāo)準(zhǔn)化和其他數(shù)據(jù)變換模型標(biāo)準(zhǔn)化。

全局縮放方法最初是為bulk RNA分析而發(fā)展起來的，通過特定的縮放因子對(duì)全局?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行縮放（Finak等，2015）。每萬計(jì)數(shù)（CPT）變換和每百萬計(jì)數(shù)（CPM）變換是常見的線性縮放方法，在不考慮spike-in count的情況下，它們都對(duì)每個(gè)UMI/總UMI count等距縮放。其他標(biāo)準(zhǔn)化方法包括每百萬reads數(shù)（RPM）（Mortazavi等，2008）、修剪均值M值（TMM）、DESeq（Robinson and Oshlack, 2010）、上四分位縮放（Bullard等，2010）、FPKM（Trapnell等，2010）、RPKM（Tu等，2012）等，它們對(duì)于極值的穩(wěn)定性比線性縮放更好，因此與RPKM/FPKM一樣具有更廣泛的應(yīng)用范圍。但單獨(dú)使用該類方法進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，由于數(shù)據(jù)的稀疏性和假陽性率虛高，效果并不可接受（Evans等，2018），與特定方法結(jié)合時(shí)往往需要改進(jìn)。SCnorm使用分位數(shù)回歸方法來評(píng)估不同測(cè)序深度依賴細(xì)胞組之間的尺度因子（Bacher等，2017）。bayNorm基于基因原始計(jì)數(shù)與真實(shí)計(jì)數(shù)服從負(fù)二項(xiàng)（NB）分布的假設(shè)，使用集成貝葉斯模型對(duì)scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（Tang等，2020）。

spike-in標(biāo)準(zhǔn)化方法可以看作是全局尺度方法的另一種擴(kuò)展，因?yàn)槌叨纫蜃邮歉鶕?jù)spike-in基因計(jì)算出來的。需要注意的是，將RNA spike-ins的信息添加到其他方法中也可以提高SCnorm等標(biāo)準(zhǔn)化的效果。GRM是一種基于spike-in ERCC分子濃度伽馬分布的方法，其中ERCC是測(cè)序中常用的校準(zhǔn)材料（Ding等，2015）。BASiCS 是一種自動(dòng)貝葉斯標(biāo)準(zhǔn)化方法，將泊松分層模型應(yīng)用于spike-in（技術(shù)）基因，以推斷細(xì)胞特定的標(biāo)準(zhǔn)化常數(shù)（Vallejos等，2015）。

以上方法都是在細(xì)胞內(nèi)RNA數(shù)量恒定的假設(shè)下對(duì)基因進(jìn)行縮放，而這可能具有欺騙性，因此其他轉(zhuǎn)化模型采用了不同的策略。由于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)存在零膨脹問題，一些模型就是為此而設(shè)計(jì)的，例如相對(duì)對(duì)數(shù)表達(dá)（RLE）方法ascend（Senabouth等，2019）和基于NB的模型，如Dino（Brown等，2021）、scTransform（Hafemeister and Satija, 2019）。其他轉(zhuǎn)化模型歸一化方法如MUREN使用最小二乘（LTS）回歸算法（Feng and Li, 2021）；Sanity使用從UMI計(jì)數(shù)推斷出的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)錄商（LTQ）作為貝葉斯框架的輸入，以避免泊松波動(dòng)，因?yàn)長(zhǎng)TQ向量的變化估計(jì)了基因表達(dá)值（Breda等，2021）；PsiNorm 是一種基于無監(jiān)督帕累托分布尺度參數(shù)的方法，用于提升標(biāo)準(zhǔn)化效率和準(zhǔn)確率（Borella等，2021）。Charles Wang 比較了 sctransform、TMM、DESeq 等共 8 種標(biāo)準(zhǔn)化方法，其中 sctransform 和 logCPM（Seurat 的內(nèi)置處理方法）受數(shù)據(jù)影響最小，在可變數(shù)據(jù)集上最穩(wěn)定（Chen等，2021a）。

（2）批次效應(yīng)校正
由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、測(cè)序平臺(tái)、測(cè)序時(shí)間、人員操作流程等原因，不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)在mRNA捕獲效率、測(cè)序深度等會(huì)存在明顯差異，從而產(chǎn)生樣本間的批次效應(yīng)（Chen等，2019a ；Hwang等，2018 ；Tung等，2017）。理論上可以通過實(shí)驗(yàn)策略消除技術(shù)變異，但由于實(shí)驗(yàn)過程的客觀限制以及測(cè)序儀器誤差，不可避免地會(huì)或多或少地引入批次效應(yīng)。利用計(jì)算方法進(jìn)行校正是解決不完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的必要手段，通常使用的方法可以分為相互最近鄰（MNN）方法、基于潛在空間的方法、基于圖的方法、DL方法和其他方法。

MNN首先識(shí)別出不同批次之間同一細(xì)胞類型的最相似細(xì)胞，然后利用這些細(xì)胞進(jìn)行批次效應(yīng)校正，包括batchelor（Haghverdi等，2018）、Scanorama（Hie等，2019）、Canek（Loza等，2022）。另一類使用 MNN 的方法是基于降維后的潛在空間，如 Seurat ( Satija等，2015 )、BEER ( Zhang等，2019b )、SMNN ( Yang等，2021a )、iSMNN ( Yang等，2021b )。例如，Seurat 使用典型相關(guān)分析 (CCA)潛在空間中的 MNN 對(duì) (稱為“錨點(diǎn)” )來匹配相似細(xì)胞，而 BEER 使用主成分分析 (PCA)子空間來篩選相似性較差的子群。SMNN 和 iSMNN 分別采用監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)和迭代監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)來細(xì)化從預(yù)校正細(xì)胞聚類或迭代細(xì)胞聚類信息中訓(xùn)練出的MN對(duì)。

基于潛在空間的方法是指在隱藏空間或降維后的嵌入中進(jìn)行批次效應(yīng)校正的方法，除了基于 MNN 聚類的策略外，還有與 PCA 相關(guān)的空間方法 Harmony（Korsunsky等，2019）、FIRM（Ming等，2022）、Monet（Wagner, 2020）；t 分布隨機(jī)鄰域嵌入 (tSNE)空間方法 sc_tSNE（Aliverti等，2020）和 ZINBWaVE（Gao等，2019）。Harmony 被廣泛用于去除樣本間的批次效應(yīng)，使用 PCA 方法將排序的細(xì)胞輸入到單個(gè)公共嵌入中，然后在最大多樣性聚類和線性批次校正之間迭代循環(huán)，直到為每個(gè)細(xì)胞分配一個(gè)特定的校正因子，可用于后續(xù)的批次效應(yīng)去除。Sc_tSNE方法引入梯度下降算法對(duì)傳統(tǒng)t-SNE算法進(jìn)行優(yōu)化，隨后采用線性校正（Aliverti等，2021）。ZINB-WaVE最初設(shè)計(jì)用于在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中進(jìn)行基因提取， Risso et al.（2018）將該方法擴(kuò)展至小批量?jī)?yōu)化。

基于圖的方法利用細(xì)胞基因表達(dá)矩陣將數(shù)字信息轉(zhuǎn)化為空間構(gòu)造的圖，其中節(jié)點(diǎn)代表不同類型的批次，邊的權(quán)重基于不同的計(jì)算方法。BBKNN利用k近鄰細(xì)胞構(gòu)建圖（KNN圖），通過使用均勻流形近似與投影（UMAP）方法合并不同數(shù)據(jù)集間單個(gè)細(xì)胞的圖實(shí)現(xiàn)批次效應(yīng)校正，這也是Scanpy工作流程中的默認(rèn)方法（Pola ński等，2020 ; Wolf等，2018）。王波在 OCAT 中提出“幽靈細(xì)胞” （默認(rèn)為 k-means 算法聚類中心）來制作細(xì)胞連接的二分圖（Wang等，2022a）。

近年來，深度學(xué)習(xí)方法的快速發(fā)展也為批次效應(yīng)校正提供了新思路，實(shí)現(xiàn)高效、大通量的數(shù)據(jù)處理，如 INSCT（Simon等，2021）（三重態(tài)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）、CLEAR（Han等，2022）（自監(jiān)督對(duì)比學(xué)習(xí)）、BERMUDA（Wang等，2019e）（遷移學(xué)習(xí)）、iMAP（Wang等，2021a）（VAE-GAN）、ResPAN（Wang等，2022e）（Wasserstein GAN），一些新方法被證明在批次效應(yīng)校正方面有更好的效果；例如，基于從SciBet學(xué)習(xí)到的帶注釋數(shù)據(jù)集中的生物學(xué)先驗(yàn)知識(shí)，SSBER可以在大型RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集中去除批次效應(yīng)（Zhang and Wang，2021）。建議在整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之前，應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)的實(shí)際情況先測(cè)試多種方法，然后選擇最合適的批次效應(yīng)去除方法。例如，Jinmiao Chen團(tuán)隊(duì)和Charles Wang團(tuán)隊(duì)分別于2020年和2021年對(duì)本綜述2.2中提到的前三種方法的大部分進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試，證明了Harmony和Seurat V3在大多數(shù)情況下都能達(dá)到良好的批次效應(yīng)校正效果，這符合這兩種方法如今仍然被廣泛使用，但對(duì)于深度學(xué)習(xí)方法來說仍然缺乏好的指標(biāo)這一事實(shí)（Chen等，2021a ；Tran等，2020）。

（3）填補(bǔ)
測(cè)序過程中會(huì)引入大量0值（高通量大規(guī)模10x基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中零值可能超過90%）（Stegle等，2015 ; Talwar等，2018），這會(huì)干擾下游生物學(xué)差異分析，因此必須對(duì)原始基因表達(dá)矩陣中的缺失數(shù)據(jù)值進(jìn)行填補(bǔ)，同時(shí)有效區(qū)分技術(shù)噪音零值與生物學(xué)零值。

基因 / 細(xì)胞分離方法主要應(yīng)用于早期的填補(bǔ)，其分別考慮細(xì)胞相似性（MAGIC ( van Dijk等，2018 )、Sclmpute ( Li and Li, 2018 )、VIPER ( Chen and Zhou, 2018 )、RESCUE ( Tracy等，2019 )、scRMD ( Chen等，2020a )、scRoc ( Ran等，2020 )）或基因間關(guān)系（SAVER ( Huang等，2018a )、SAVER-X ( Wang等，2019a )、G253 ( Wu等，2021e )、DCA ( Eraslan等，2019 )、DeepImpute ( Arisdakessian等，2019 )）�？傮w而言，這些方法缺乏對(duì)數(shù)據(jù)集整體的考慮，容易導(dǎo)致過度插補(bǔ)或者引入誤差（Zhang等，2019d）。綜合方法綜合考慮細(xì)胞與基因之間的聯(lián)系：CMF-Impute和netNMF-sc是最早有效利用細(xì)胞與基因之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行插補(bǔ)的方法（Elyanow等，2020 ；Xu等，2020a）。scIGANs通過特定的GAN模型處理基因表達(dá)矩陣，利用生成的細(xì)胞訓(xùn)練GANs模型來插補(bǔ)dropout（Xu等，2020b）。近年來，新的方法還在不斷被提出，以更好地解決dropout之外的技術(shù)噪聲對(duì)數(shù)據(jù)的影響，并實(shí)現(xiàn)對(duì)生物零值的更好的區(qū)分。AutoClass（Li等，2022c）實(shí)現(xiàn)了無監(jiān)督處理，而ALRA方法主要針對(duì)生物零值（Linderman等，2022）。scMOO進(jìn)行了根本性的改變，利用數(shù)據(jù)的潛在結(jié)構(gòu)來學(xué)習(xí)細(xì)胞相似性垂直結(jié)構(gòu)和總低秩結(jié)構(gòu)中的深度關(guān)聯(lián)，從而取得了比單一基因表達(dá)矩陣作為輸入更好的插值效果，但對(duì)內(nèi)存的要求也更高（Jin等，2022a）。sc-PHENIX利用PCA-UMAP初始化方法，實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)的非線性插值（Padron-Manrique等，2022），目前哪種插值能取得最佳效果尚無明確定論。由于數(shù)據(jù)集本身的原因，下游分析的目的會(huì)有不同的選擇，但毫無疑問最好的填補(bǔ)方法將能夠以較低的計(jì)算要求有效區(qū)分技術(shù)噪聲零值和生物零值（Jiang等， 2022a ；Wen等， 2022）。

（4）特征選擇
為了降低數(shù)據(jù)維數(shù)以提升計(jì)算分析效率、減少技術(shù)噪聲干擾和模型過擬合的風(fēng)險(xiǎn)，我們常常采取特征選擇策略，選取不同細(xì)胞中差異較大的基因，而非整個(gè)數(shù)據(jù)集基因進(jìn)行聚類等后續(xù)分析（Brennecke等， 2013 ；Jackson and Vogel， 2022 ；Svensson等， 2017）。

在bulk RNA-seq分析中，尋找差異基因的方法通常包括基于倍數(shù)變化（FC）的方法、基于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的方法和FC-統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法，顯然后者的篩選結(jié)果和可信度最好（Chung and Storey，2015）。

早期的單細(xì)胞特征選擇方法缺乏平均表達(dá)量與方差之間的校正，導(dǎo)致結(jié)果中高表達(dá)基因的比例過高（Brennecke等，2013）。EDGE采用大量弱學(xué)習(xí)器的集成學(xué)習(xí)方法來學(xué)習(xí)細(xì)胞間相似性概率，提取基于信息熵的顯著貢獻(xiàn)作為高可變基因（Sun等，2020c）。同樣，SAIC基于迭代聚類最終輸出實(shí)現(xiàn)了最優(yōu)細(xì)胞簇分離（Yang等，2017）。近期，一些新的特征提取策略被提出并證明了其穩(wěn)定性和有效性，但它們之間的性能權(quán)威驗(yàn)證尚缺乏：包括基于基因表達(dá)分布矩陣的方法 SCMER（Liang等，2021b）、RgCop（Lall等，2021）、scPNMF（Song等，2021a）、SIEVE（Zhang等，2021e）；基于熵的方法 IEntropy（Li等，2022g）、infohet（Casey等，2023）；綜合考慮聚類的方法有Triku（Ascensión等，2022）、FEAST（Su等，2021）等。由于上述方法絕大多數(shù)忽略了整體的依賴于基因表達(dá)的特征，因此提出了綜合的方法，如Triku使用k最近鄰圖的方法對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行綜合探索和分類，實(shí)現(xiàn)無偏差地篩選出更有生物學(xué)意義的特征基因；FEAST在共識(shí)聚類上通過f檢驗(yàn)對(duì)特征進(jìn)行排序，并基于特征評(píng)估算法提取HVG（Wang等，2022c）。

其他一些方法使用高可變基因以外的特征來表示數(shù)據(jù)集，例如scVEGs和scSensitiveGeneDefine方法，使用高變異系數(shù)（CV）作為特征提�。籅ASiCS方法利用spike-in基因的信息（Chen等，2016b ；Chen等，2021b）�？傮w來看，基于準(zhǔn)確性、生物學(xué)可解釋性等角度，當(dāng)前特征選擇的主要目標(biāo)是有效提取HVG，以便對(duì)高維轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的下游分析。

（5）降維
由于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組通常包含數(shù)萬個(gè)甚至更多的基因，不利于直接提取有效信息，在實(shí)際分析過程中，通常需要對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行降維。除了利用前文提到的特征選擇方法處理高維單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)外，降維也是一種有效的方法，根據(jù)降維策略可分為線性降維（基于潛在狄利克雷分配（LDA）的方法、基于PCA的方法）和非線性降維（基于t-SNE的方法、基于UMAP的方法）（Andrews and Hemberg，2018 ；Becht等，2019 ；Laurens and Hinton，2008 ；Peres-Neto等，2005）。

在線性降維中，LDA和PCA是兩種廣泛使用的算法，LDA從分類最大的角度區(qū)分特征，而PCA則從方差最大的角度正交提取主成分。盡管有JPCDA、LDA-PLS等改進(jìn)算法，但是LDA模型在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的降維效果仍然不是最優(yōu)的（Tang等，2014 ; Zhao等，2020）。PCA是另一種線性變換，Seurat通常根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差-PC圖的拐點(diǎn)或者PC的比例檢驗(yàn)結(jié)果P值（ScoreJackStraw函數(shù)）來確定PC數(shù)量的多少。其他基于PCA的降維方法的變體包括pcaReduce（Žurauskien ė和Yau，2016），GLM-PCA（Townes等，2019），RPCA（Gogolewski等，2019），tRPCA（Candès等，2011），scPCA（Boileau等，2020），PCAone（Li等，2022l）。GLM-PCA將傳統(tǒng)PCA分析擴(kuò)展到非正態(tài)分布，通過引入指數(shù)家族似然策略直接處理原始矩陣，使PCA擺脫正態(tài)化限制，然后使用偏差對(duì)基因?qū)崿F(xiàn)進(jìn)行排序和提�。–ollins等，2002）。ScPCA使用對(duì)比PCA和稀疏PCA分別去除技術(shù)噪音和數(shù)據(jù)，進(jìn)一步增加了PCA的穩(wěn)定性（Abid等，2018 ; Zou等，2006）。由于大多數(shù)scRNA-seq數(shù)據(jù)集難以通過簡(jiǎn)單的線性降維進(jìn)行有效表示，解決這一問題的第一個(gè)策略是基于快速PCA分析方法。PCAone提出了一種新的快速隨機(jī)奇異值分解（RSVD）策略，在35分鐘內(nèi)完成130萬小鼠腦細(xì)胞單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析（Li等，2022l）。

非線性降維是另一種解決方案，如非參數(shù)降維方法t-SNE和UMAP，都需要預(yù)先設(shè)置聚類的超參數(shù)；而在分類效果上，前者傾向于離散數(shù)據(jù)中細(xì)胞的形成。在合理使用參數(shù)設(shè)定的情況下，UMAP與t-SNE并無明顯差異，即在使用相同的信息初始化方法后，二者可以在保留數(shù)據(jù)集全局結(jié)構(gòu)的同時(shí)，產(chǎn)生近似的分析效率（Do and Canzar，2021 ；Kobak and Linderman，2021）。針對(duì)t-SNE的改進(jìn)方法包括net-SNE、qSNE、FItSNE、聯(lián)合t-SNE（Cho等，2018a ；Linderman等，2019 ；Wang等，2022b），而UMAP的改進(jìn)主要來自于Leland McInnes課題組對(duì)該方法的自我改進(jìn)（McInnes等，2018）。為了更好地可視化t-SNE或UMAP的降維結(jié)果，Hyunghoon Cho提出了基于局部半徑依賴優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄組變異信息den-SNE/densMAP方法，以迭代優(yōu)化傳統(tǒng)t-SNE/UMAP的功能；Stefan Canzar提出了j-SNE/jUMAP來改善多模態(tài)組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合可視化結(jié)果，減少可視化的誤導(dǎo)性（Do and Canzar，2021 ；Narayan等，2021）。

（6）聚類
在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，通過聚類將細(xì)胞劃分為亞群，從而能夠表征多細(xì)胞生物中不同細(xì)胞類型，這有助于我們從細(xì)胞異質(zhì)性的角度準(zhǔn)確地分析不同的組織或發(fā)育過程。聚類的實(shí)際效果會(huì)受到數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟的影響，例如浴效應(yīng)歸一化、歸納、降維等。

在特征基因選擇和降維之后，絕大多數(shù)單細(xì)胞是基于距離進(jìn)行聚類的。K 均值聚類算法的概念被用于 SCUBA、SC3 和 RaceID 等應(yīng)用（Grün等，2015 ；Kiselev等，2017 ；Macqueen, 1967 ；Marco等，2014）。在參數(shù)選擇改進(jìn)方面，SAIC 通過 Davies-Bouldin 指數(shù)迭代優(yōu)化多個(gè)初始中心K和P值，以獲得最優(yōu)解；LAK 將參數(shù)選擇算法應(yīng)用于數(shù)據(jù)集，實(shí)現(xiàn)參數(shù)的自動(dòng)選擇（Davies and Bouldin, 1979 ；Hua等，2020 ；Yang等，2017）。在超高維數(shù)據(jù)的操作中，LAK添加Lasso懲罰項(xiàng)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，mbkmeans使用小批量k均值實(shí)現(xiàn)百萬細(xì)胞級(jí)別的快速聚類（Hicks等，2021）。SMSC應(yīng)用譜聚類方法來提高聚類性能，但對(duì)于超高維數(shù)據(jù)會(huì)損失一定的準(zhǔn)確性（Qi等，2021）。另一大類廣泛使用的距離聚類方法依賴于共享最近鄰圖結(jié)構(gòu)和圖聚類，其中使用最廣泛的是Louvain或Leiden（Blondel等，2008 ；Xu and Su, 2015）。稀有細(xì)胞的識(shí)別需要結(jié)合特定方法進(jìn)行改進(jìn)，例如dropClust使用局部敏感哈希工作流篩選最近鄰，然后是Louvain聚類，它使用指數(shù)衰減函數(shù)來保留更多稀有細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征（Sinha等，2018）。其他基于距離的聚類方法使用不同的算法核心：SIMLR使用高斯核學(xué)習(xí)模型為數(shù)據(jù)集中潛在的C細(xì)胞群體構(gòu)建核矩陣，而Conos提出聯(lián)合相互最近鄰（mNN）圖聚類來實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)不同單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組樣本的整合分析（Barkas等，2019 ; Wang等，2017a）。基于密度的聚類利用樣本分布的接近程度進(jìn)行聚類，DBSCAN是最經(jīng)典的算法（Ester等，1996 ; Fukunaga and Hostetler, 1975）。對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序，densityCut和FlowGrid就是基于此原理設(shè)計(jì)的（Ding等，2016 ; Fang and Ho, 2021）。層次聚類是一種自下而上的聚類方法，通過無監(jiān)督學(xué)習(xí)，不斷重復(fù)計(jì)算細(xì)胞與細(xì)胞的相似性進(jìn)行分類，直至完成預(yù)設(shè)的聚類數(shù)（Guo等，2015）。隨后，RCA聚類采用常規(guī)的層次聚類方法，對(duì)映射到全局參考面板的細(xì)胞進(jìn)行聚類；HGC在SNN圖上構(gòu)建層次樹（Li等，2017 ；Zou等，2021）。為了解決常規(guī)層次聚類方法難以對(duì)某一組細(xì)胞進(jìn)行聚類、只允許同一組特征基因進(jìn)行聚類的缺陷，K2Taxonomer采用約束K均值算法擴(kuò)展到樣本組，基于多個(gè)基因集遞歸進(jìn)行積分計(jì)算，以捕獲各種分辨率下的亞組（“類似分類學(xué)的細(xì)胞”）（Reed and Monti, 2021）。Mrtree將層次聚類的策略應(yīng)用于平面簇的多個(gè)劃分，并構(gòu)造多分辨率協(xié)調(diào)樹用于細(xì)胞聚類（Peng等，2021a）。最近， Zelig和Kaplan（2020）提出了一種KMD聚類方法，通過平均鏈接層次聚類模型在聚類時(shí)消除了超參數(shù)K，大大減少了主觀性帶來的判斷誤差。

深度學(xué)習(xí)聚類方法是將機(jī)器學(xué)習(xí)方法與上述單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聚類策略相結(jié)合，可以以無監(jiān)督、監(jiān)督或半監(jiān)督的形式實(shí)現(xiàn)更高效的聚類結(jié)果。這些方法傾向于學(xué)習(xí)一種非線性變換，通過將原始高維數(shù)據(jù)映射到較小的潛在空間中來獲得最佳的低維表示�？傮w而言，這種方法避免了傳統(tǒng)聚類方法對(duì)聚類前數(shù)據(jù)處理方法選擇的影響。無監(jiān)督聚類方法包括ADClust、DESC、SAUCIE、VAE-SNE等，通常不需要預(yù)設(shè)聚類個(gè)數(shù)等參數(shù)，以自主學(xué)習(xí)的方式完成對(duì)數(shù)據(jù)集的分析處理（Amodio等，2019 ；Graving and Couzin，2020 ；Li等，2020c ；Zeng等，2022c）。雖然無監(jiān)督聚類方法避免了手動(dòng)輸入聚類個(gè)數(shù)等參數(shù)，可以延伸到超高維細(xì)胞聚類，但有時(shí)利用高質(zhì)量標(biāo)注數(shù)據(jù)集或其他先驗(yàn)知識(shí)輔助約束進(jìn)行監(jiān)督或半監(jiān)督聚類，可以實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確的細(xì)胞類型分類，提高聚類性能（Bai等，2021）。基于遷移學(xué)習(xí)的ItClust、基于互監(jiān)督ZINB自編碼器和圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（GNN）的scDSC、基于軟K均值卷積自編碼器的ScCAE、基于Cramer-World距離最大均值懲罰高斯混合自編碼器的SeGMA、基于時(shí)間序列聚類網(wǎng)絡(luò)STCN都是廣泛使用的監(jiān)督聚類（Gan等，2022 ; Hu等，2022a ; Hu等，2020a ; Ma等，2021b ; Smieja等，2021）。此外，Zhang團(tuán)隊(duì)（Yang等，2023b）利用分層GAN設(shè)計(jì)了另一種廣泛使用的深度學(xué)習(xí)方法IMDGC，用于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，以生成的方式構(gòu)建細(xì)胞嵌入簇。

針對(duì)聚類中的特殊情況，設(shè)計(jì)了有針對(duì)性的聚類方法：GiniClust（Jiang等，2016）（更新為GiniClust 3（Dong and Yuan，2020））、MicroCellClust（Gerniers等，2021）用于稀有細(xì)胞亞群聚類；EDClust（Wei等，2022）、ENCORE（Song等，2021b）和MLG（Lu等，2021）用于降噪和消除批次效應(yīng)；ClonoCluster（克隆起源信息）（Richman等，2023）、IsoCell（可變剪接信息）（Liu等，2023）使用附加信息進(jìn)行聚類。Wu 和 Yang 從特征選擇對(duì)聚類的影響的角度對(duì)聚類方法進(jìn)行了評(píng)估，他們證明更具代表性的特征選擇會(huì)提高細(xì)胞聚類的水平，基于“聚類相似性”的方法（我們綜述中提到的大多數(shù)基于距離的聚類方法）通常具有廣泛的高聚類類型性能；然而，高精度和高運(yùn)行速度需要根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)集進(jìn)行有針對(duì)性的選擇（Su等，2021 ；Yu等，2022）。雙重浸入 (double dipping)是一個(gè)顯著的問題，即在細(xì)胞聚類和差異表達(dá)基因中使用相同的表達(dá)數(shù)據(jù)，導(dǎo)致在細(xì)胞聚類不正確時(shí) DE 基因的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (FDR)過高。例如，如果只存在一個(gè)特定的細(xì)胞聚類，則不應(yīng)將任何基因視為差異基因。為了系統(tǒng)地解決這個(gè)問題，ClusterDE 采用了聚類對(duì)比學(xué)習(xí)策略進(jìn)行聚類后 DE 測(cè)試。該方法與截?cái)嗾龖B(tài)分布 (TN)檢驗(yàn)和 Countsplit 方法相比，在不同閾值范圍內(nèi)具有更好的 FDR 控制 ( Song等，2023a )。

(7) 細(xì)胞類型注釋
細(xì)胞分型注釋是指利用特定的信息對(duì)單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)集中的細(xì)胞或細(xì)胞亞群進(jìn)行注釋，作為后續(xù)生物學(xué)分析的基礎(chǔ)。最常用的策略是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類，然后根據(jù)標(biāo)記基因進(jìn)行注釋，例如 scCATCH、SCSA ( Cao等，2020b ；Shao等，2020a )，但它難以處理復(fù)雜的高維數(shù)據(jù)集 ( Franzén等，2019 ；Luecken and Theis, 2019 ；Zhang等，2019c )。目前已經(jīng)開發(fā)了多種自動(dòng)細(xì)胞分型方法，大致可分為兩類，即依賴參考和無參考的注釋方法。

依賴參考信息的注釋方法要求用戶提供預(yù)先注釋的高質(zhì)量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集或來自 PanglaoDB 數(shù)據(jù)庫、ScType 數(shù)據(jù)庫等的先驗(yàn)知識(shí)進(jìn)行比對(duì)（Ianevski等，2022）。根據(jù)方法原理的不同，可分為基于層次樹的方法（CHETAH（de Kanter等，2019）、Garnett（Pliner等，2019）、HieRFIT（Kaymaz等，2021）、scHPL（Michielsen等，2021）、scMRMA（Li等，2022e））、基于相似性的方法（SingleR（Aran等，2019）、scmap（Kiselev等，2018）、deCS（Pei等，2023）、scID（Boufea等，2020）、scMatch（Hou等，2019）、Symphony（Kang等，2021））、基于簽名基因的方法（Cellassign（Zhang等，2021））、基于特征基因的方法（Cellassign（Zhang等，2022））。al., 2019a )、Cell-ID（Cortal等，2021）、scMAGIC（Zhang等，2022g）、SciBet（Li等，2020b））和其他DL方法。作為早期方法，ACTINN是一種使用3個(gè)隱藏層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行注釋分類的深度學(xué)習(xí)方法（Ma and Pellegrini, 2020）。SCPred隨后提出了一種基于嵌入的無偏特征選擇的機(jī)器學(xué)習(xí)概率預(yù)測(cè)方法（Alquicira-Hernandez等，2019）。其他方法如Seurat在PCA空間中投影查詢細(xì)胞并通過加權(quán)投票分類器訓(xùn)練細(xì)胞分型注釋；scSorter 采用高斯混合模型，GraphCS 使用虛擬對(duì)抗訓(xùn)練 (VAT)損失修改的 GNN 來擴(kuò)展到多物種、大規(guī)模細(xì)胞注釋數(shù)據(jù)集（Guo and Li，2021 ；Zeng等，2022a）。

不依賴參考信息的注釋方法使用預(yù)先訓(xùn)練的深度學(xué)習(xí)模型，可以直接使用查詢數(shù)據(jù)集作為輸入進(jìn)行細(xì)胞分類。scDeepSort 使用來自人類細(xì)胞圖譜 (HCL)和小鼠細(xì)胞圖譜 (MCA)數(shù)據(jù)庫的單細(xì)胞圖譜作為預(yù)訓(xùn)練加權(quán) GNN 模型的輸入，該模型適用于人類和小鼠細(xì)胞注釋并取得良好的效果（Han等，2018b ；Han等，2020 ；Shao等，2021b）。類似地，Pollock 是一個(gè)預(yù)訓(xùn)練的人類癌癥參考 VAE 模型，用于對(duì)癌癥環(huán)境中的多模態(tài)細(xì)胞進(jìn)行分類（Storrs等，2022）。雖然使用起來更方便，但對(duì)于差異顯著的查詢數(shù)據(jù)集難以達(dá)到更好的細(xì)胞注釋效果，而且由于準(zhǔn)確性和預(yù)訓(xùn)練參考數(shù)據(jù)集的數(shù)量也難以擴(kuò)展應(yīng)用。還有一些其他用于有針對(duì)性領(lǐng)域研究的細(xì)胞注釋工具，例如，用于人類腎細(xì)胞注釋的 DevKidCC（Wilson等，2022），用于識(shí)別癌癥和正常細(xì)胞的 ikarus（Dohmen等，2021）�？傮w而言，無參考注釋方法的性能受到預(yù)訓(xùn)練參考數(shù)據(jù)集的覆蓋率和準(zhǔn)確性的制約。

目前，改進(jìn)細(xì)胞注釋工具以在大平臺(tái)和多細(xì)胞模式下統(tǒng)一分配細(xì)胞類型是細(xì)胞注釋研究的主流方向，最新的Cellar和ELeFHAnt方法在這方面做了一些嘗試并取得了初步成果（Hasanaj等，2022 ; Thorner等，2021）�？傮w而言，基于相似性的注釋方法計(jì)算量大，在應(yīng)用于非常大的查詢和參考數(shù)據(jù)集時(shí)，往往會(huì)在準(zhǔn)確率和速度之間做出權(quán)衡，因此一般只適合在較小的數(shù)據(jù)集中進(jìn)行細(xì)胞分類；對(duì)于較大規(guī)模的數(shù)據(jù)集，建議使用F檢驗(yàn)特征選擇或MLP分類器（Hu等，2020a ; Huang and Zhang, 2021 ; Ma等，2021c）。此外，半監(jiān)督遷移學(xué)習(xí)的方法，如Itclust，在發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞型方面也有不錯(cuò)的效果。近年來，基于上述參考注釋方法分類的新方法不斷完善，VAE等深度學(xué)習(xí)模型也在該領(lǐng)域得到應(yīng)用。

（8）差異表達(dá)分析（DEG ）
統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)是Bulk RNA-seq的差異基因分析中常用到的方法，類似章節(jié)2.4HVG Selection算法：通常以P值和對(duì)數(shù)倍變化量作為重要參數(shù)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)包括t檢驗(yàn)（兩個(gè)樣本為基礎(chǔ)），Wilcoxon檢驗(yàn)，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)（KS檢驗(yàn)），Kruskal-Wallis檢驗(yàn)（KW檢驗(yàn)），其中一些在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組DEGs的檢驗(yàn)中也被廣泛使用�；�于此，發(fā)展了相應(yīng)的檢測(cè)工具：limma（Ritchie等，2015），edgeR（Robinson等，2010），DESeq2（Love等，2014）。limma和edgeR算法均由Smyth GK提出，前者基于正態(tài)或近似正態(tài)分布模型，后者基于過度離散的泊松分布模型。DESeq2基于NB分布模型進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，對(duì)DEG采用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯程序。目前l(fā)imma由于特定的分布模型假設(shè)，在RNA計(jì)數(shù)分析中誤差較大，雖然edgeR和DESeq2都利用貝葉斯模型對(duì)過度離散進(jìn)行歸一化，但后者通過數(shù)據(jù)集reads的平均值和異常值檢測(cè)促進(jìn)了CPM閾值的篩選，分析效果更好。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組DEG按照時(shí)間和分析方法大致可以分為早期零值參數(shù)檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)和其他方法。由于scRNA-seq數(shù)據(jù)中存在大量零數(shù)，早期的方法大多基于此觀察做參數(shù)檢驗(yàn)，例如Monocle ( Trapnell等，2014 )、SCDE ( Kharchenko等，2014 )、MAST ( Finak等，2015 )、scDD ( Korthauer等，2016 )、D3E ( Delmans and Hemberg, 2016 )、TASC ( Jia等，2017 )、DEsingle ( Miao等，2018 )和HIPPO ( Kim等，2020b )。對(duì)以上一些方法的評(píng)測(cè)表明，雖然它們?cè)趩渭?xì)胞數(shù)據(jù)集的分析中普遍取得了不錯(cuò)的效果，但對(duì)于批量數(shù)據(jù)（Soneson and Robinson, 2018）相比DEA方法并沒有明顯的性能提升。對(duì)于不同的數(shù)據(jù)集，有可能沒有最好的分布模型，因此一種替代解決方案是考慮非參數(shù)DEA方法。

非參數(shù)檢驗(yàn)或無分布檢驗(yàn)不需要對(duì)數(shù)據(jù)分布形式做事先假設(shè)，因此適用于多數(shù)據(jù)集的分析，常用方法有Swish（Zhu等，2019a）、IDEAS（Zhang等，2022d）、ccdf（Gauthier等，2021）、distinct（Tiberi等，2022）。Swish通過Salmon Gibbs評(píng)估轉(zhuǎn)錄本水平，然后用Mann-Whitney Wilcoxon檢驗(yàn)計(jì)算FC值。IDEAS是一種使用Jensen-Shannon散度（JSD）或Wasserstein距離（Was）進(jìn)行基因差異表達(dá)測(cè)量的偽F統(tǒng)計(jì)量檢驗(yàn)， P值由基于PERMANOVA的距離測(cè)試器基于核的回歸生成。Ccdf 是一種依賴條件累積分布函數(shù)的條件獨(dú)立性檢驗(yàn)，通過多元回歸模型預(yù)測(cè) DEG。Distinct 提出了一種分層非參數(shù)置換方法，使用經(jīng)驗(yàn)累積分布函數(shù) (ECDF)的總距離進(jìn)行 DEG 識(shí)別。替代方法包括深度學(xué)習(xí)策略 MRFscRNAseq ( Li等，2021a )、基于擬時(shí)序推斷的 PseudotimeDE ( Song and Li, 2021 )、基于非預(yù)聚類的 singleCellHaystack ( Vandenbon and Diez, 2020 )、基于多重評(píng)分的 MarcoPolo ( Kim等，2022 )。建議不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集應(yīng)采用數(shù)據(jù)特定的DEGs檢測(cè)策略，以優(yōu)化DEGs分析，基于scCODE工作流程，可以使用涉及CDO（DE基因順序）和AUCC（一致性曲線下面積）的指標(biāo)找到最優(yōu)化的DEGs方法（Zou等，2022）。此外，研究方法在不同的研究背景下會(huì)有特定的研究取向，例如在給藥后的劑量反應(yīng)研究中，DEGs分析、LRT線性檢驗(yàn)和貝葉斯多組檢驗(yàn)均比其他方法有更好的結(jié)果（Nault等，2022）。

（9）可視化
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可視化是指將上述分析結(jié)果以圖形的形式直觀地呈現(xiàn)，ggplot2是R中最廣泛的可視化工具，在R中被廣泛使用，可以大大增強(qiáng)繪圖能力（Wickham，2009）。ARL 是另一個(gè)專門顯示標(biāo)記基因關(guān)聯(lián)圖并可顯示其在每個(gè)簇中的特征的 R 包（Gralinska等，2022）。此外，還有其他專門用于標(biāo)記基因可視化的包，如 Complex Heatmap，本文不再詳細(xì)介紹。HVG 可視化通常以火山圖的形式呈現(xiàn)，默認(rèn)情況下，圖的左側(cè)和右側(cè)部分分別是代表性不足的基因和代表性過高的基因，而中間是恒定基因。Enhanced Volcano 是一個(gè)專門用于繪制火山圖的 R 包，默認(rèn)情況下也可以使用 ggplot2 來獲得更好的結(jié)果。簇可視化通常以 PCA 圖、t-SNE 圖和 UMAP 圖呈現(xiàn)，但值得注意的是，可視化的結(jié)果非常具有欺騙性，因?yàn)橐恍┬〉募?xì)胞亞群可能代表 UMAP 圖中顯示的大量細(xì)胞。為了解決這些問題，提出了den-SNE/densMAP、j-SNE/j-UMAP等改進(jìn)方法（Macqueen，1967 ；Marco等，2014）。此外，F(xiàn)astProject可以輸出注釋簇的2D顯示，PieParty可以在簇2D圖中為每個(gè)基因繪制顏色圖（DeTomaso and Yosef，2016 ；Kurtenbach等，2021）。

同時(shí)，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的交互式可視化是目前的熱門領(lǐng)域，諸如Single Cell Explorer等軟件可以一定程度上實(shí)現(xiàn)交互式可視化，但仍需增加交互自由度，以提供更全面的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)3D呈現(xiàn)（Cakir等，2020 ；Feng等，2019）。為此，CellexalVR利用VR理論進(jìn)行交互可視化；CellView 是一個(gè)基于 Web 的工具，包括用于不同用途的探索選項(xiàng)卡、共表達(dá)選項(xiàng)卡、子簇分析選項(xiàng)卡模塊；Cellxgene VIP 是一個(gè)基于 cellxgene 框架的插件，并擴(kuò)展到基于多個(gè)模塊組合的 ST 數(shù)據(jù)的交互式可視化（Bolisetty等，2017 ; Legetth等，2021 ; Li等，2022f）。

（10）單細(xì)胞模擬
隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組方法的不斷擴(kuò)展，基準(zhǔn)測(cè)試成為了重要挑戰(zhàn)，關(guān)鍵問題是需要穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)，因?yàn)閱渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組的直接測(cè)序可能缺乏基本事實(shí)。真實(shí)的單細(xì)胞模擬數(shù)據(jù)為基準(zhǔn)測(cè)試提供了已知的事實(shí)，允許使用真實(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練，同時(shí)匹配實(shí)際數(shù)據(jù)的特征。此外，模擬數(shù)據(jù)比真實(shí)數(shù)據(jù)提供了更大的靈活性，使分析師能夠根據(jù)特定的測(cè)試方法調(diào)整諸如 dropout rate 等參數(shù)。

Splatter 是一個(gè)兩步模擬框架，首先模擬來自真實(shí)數(shù)據(jù)的估計(jì)參數(shù)，然后合并來自用戶的額外參數(shù)（Zappia 等，2017）。其六個(gè)預(yù)先設(shè)計(jì)的管道模塊接口確保了數(shù)據(jù)生成的可重復(fù)性。最近的更新側(cè)重于專業(yè)化和泛化。在專業(yè)化領(lǐng)域，splaPop 生成具有遺傳效應(yīng)（數(shù)量性狀基因座）的人口規(guī)模數(shù)據(jù)，而 dyngen 模擬動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程，如發(fā)育軌跡（Azodi 等，2021 ；Cannoodt 等，2021）。在泛化領(lǐng)域，Li的團(tuán)隊(duì)介紹了理想模擬的六個(gè)概念，包括真實(shí)性、基因的保存、基因相關(guān)性的捕獲、穩(wěn)健性、參數(shù)可調(diào)性和效率（Song 等，2023b ；Sun 等，2021）。隨后，scDesign2 提出來滿足所有 6 個(gè)屬性（Sun等，2021），接著是 scDesign3，解決單細(xì)胞組學(xué)統(tǒng)計(jì)模擬的空白（Song等，2023b）。模擬準(zhǔn)確性和透明度的提高增強(qiáng)了不同單細(xì)胞數(shù)據(jù)處理方法之間的基準(zhǔn)測(cè)試，指導(dǎo)選擇最合適的方法以滿足特定數(shù)據(jù)和許可需求。

下游拓展分析
(1) 擬時(shí)序分析
為了更真實(shí)地恢復(fù)生物體中的真實(shí)過程，需要使用擬時(shí)序分析整合多個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過推斷不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞信息（包括狀態(tài)、分布、數(shù)量和基因表達(dá)）來重建細(xì)胞發(fā)育軌跡（BarJoseph等，2012 ; Bendall等，2014 ; Ding等，2022）。這種對(duì)轉(zhuǎn)錄組特征的動(dòng)態(tài)分析稱為擬時(shí)序分析（圖 4 E）。根據(jù)是否依賴于基因表達(dá)，擬時(shí)序分析方法可以分為基于基因（外顯子）表達(dá)的方法和基于RNA-velocity的方法。

基于基因表達(dá)水平的擬時(shí)序分析最早被提出，它通常利用降維等聚類方法在低維空間構(gòu)建多分支圖模型來模擬細(xì)胞的發(fā)育軌跡：基于最小生成樹(MST)的方法monocle( Trapnell等，2014 )、monocle 2( Qiu等，2017 )、TSCAN( Ji and Ji, 2016 )；基于PAGA 的方法PAGA( Wolf等，2019 )、monocle 3( Cao等，2019 )；其他圖架構(gòu)方法Wishbone( Setty等，2016 )、p-Creode( Herring等，2018 )等都用于此目的。MST是連接二維平面上所有點(diǎn)的模型，具有最低的總連接權(quán)重，最早用于解決旅行商問題， Qiu et al. (2011)在2011年應(yīng)用Boruvka算法構(gòu)建的MST模型來分析細(xì)胞層級(jí)。Monocle將細(xì)胞映射到高維歐氏空間，并使用ICA降維，Monocle 2更新單片機(jī)并使用反向圖嵌入(RGE)策略構(gòu)建細(xì)胞路徑，隨后細(xì)胞分布到使用質(zhì)心構(gòu)建的生成樹上。PAGA(基于分區(qū)的圖抽象)通過鄰域圖權(quán)重(默認(rèn)為KNN圖)的統(tǒng)計(jì)連通性度量保留數(shù)據(jù)集的全局拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，基于擴(kuò)展擴(kuò)散擬時(shí)序(DPT)方法生成多種分辨率的PAGA圖進(jìn)行擬時(shí)序分析。Monocle 3結(jié)合了monocle 2和PAGA的優(yōu)點(diǎn)，在UMAP空間上形成多個(gè)PAGA圖，然后使用SimplePPT算法學(xué)習(xí)主圖，再通過其他PAGA圖的約束，最終得出的細(xì)胞發(fā)育軌跡可以適應(yīng)具有成分復(fù)雜性的大數(shù)據(jù)集。總體而言，PAGA和monocle 3綜合考慮了計(jì)算速度、準(zhǔn)確性和魯棒性，是目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擬時(shí)序分析的最佳方法。除了圖方法外，其他基于基因表達(dá)的方法還包括CSHMM，利用HMM模型計(jì)算每個(gè)細(xì)胞到根細(xì)胞的距離，然后迭代完成細(xì)胞軌跡分配；SCUBA，采用分叉分析模型；SLICE，由于高度分化的細(xì)胞使scEntropy最小化，因此提出了一個(gè)scEntropy有向模型（Guo等，2017 ；Lin and Bar-Joseph，2019 ；Marco等，2014）。

基于RNA速率的方法依賴于RNA速率信息，該方法由Peter V. Kharchenko小組（La Manno等，2018）于2018年首次提出，他們認(rèn)為未剪接/剪接mRNA的比例可用于推斷轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，因?yàn)槲醇艚觤RNA比例較高的細(xì)胞更年輕（作為較晚的細(xì)胞分化狀態(tài)）。同時(shí)，他們還提出了專門的分析軟件velocyto（可通過R包velocyto.R獲得）作為穩(wěn)態(tài)模型來量化RNA速率以進(jìn)行發(fā)育軌跡分析。scVelo是另一種專門為RNA速率設(shè)計(jì)的分析工具，它使用基于似然的動(dòng)力學(xué)模型來解決具有穩(wěn)態(tài)mRNA水平的細(xì)胞軌跡推斷，并且情況違反了常見剪接速率的中心假設(shè)（Bergen等，2020）。但速度投影方法仍有方法論改進(jìn)的空間：恒定降解和核輸出假設(shè)仍需證明。這也為后續(xù)基于RNA速率的方法提供了方向（Bergen等，2021）。深度學(xué)習(xí)相關(guān)方法被廣泛應(yīng)用于RNA速率的建模預(yù)測(cè)，以進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)大型復(fù)雜數(shù)據(jù)集的處理能力，如貝葉斯分層模型BRIE2（Huang and Sanguinetti，2021）；基于速度自編碼模型的VeloAE（Qiao and Huang，2021）；變分自編碼模型DeepCycle（Riba等，2022）。

（2）細(xì)胞間相互作用
細(xì)胞間相互作用（CCI）是多細(xì)胞生物維持正常生理功能的重要特征，決定了細(xì)胞的命運(yùn)，探討疾病發(fā)生的機(jī)制，探索遺傳變異過程和其他調(diào)控過程（Shao等，2020b ；Singer, 1992）。細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)直觀地體現(xiàn)了細(xì)胞間的相互作用關(guān)系（圖4 F）。

基于鄰域結(jié)構(gòu)的直接CCI是指利用細(xì)胞間的物理距離，對(duì)有可能直接接觸的CCI進(jìn)行提取和分析。ProximID方法對(duì)具有預(yù)定相互作用距離（歐幾里德距離）的合格細(xì)胞完成物理細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（Boisset等，2018）。Neighbor-seq使用隨機(jī)森林分類器識(shí)別細(xì)胞類型，通過igraph方法利用富集分?jǐn)?shù)計(jì)算得分構(gòu)建CCI網(wǎng)絡(luò)（Csardi and Nepusz, 2006 ; Ghaddar and De, 2022）。由于這種分析方法的局限性很大，目前并不單獨(dú)使用。這種KNN連通圖通常作為深度學(xué)習(xí)中CCI的輸入之一，其物理距離也成為單細(xì)胞CCI研究中的一個(gè)重要假設(shè)（兩個(gè)物理上直接接觸的相鄰細(xì)胞比兩個(gè)隨機(jī)細(xì)胞更有可能發(fā)生某種形式的相互作用），用于全局CCI分析。

間接接觸的CCI關(guān)系完整過程應(yīng)包括配體、受體、信號(hào)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子（TF）和靶基因。常見的間接CCI方法主要利用先驗(yàn)的配體-受體對(duì)數(shù)據(jù)庫（如CellTalkDB數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了經(jīng)過驗(yàn)證的3,398個(gè)人類LR對(duì)和2,033個(gè)小鼠LR對(duì)的信息（Shao等，2021a）），制作細(xì)胞-細(xì)胞連接矩陣，其中每個(gè)值代表LR對(duì)的共表達(dá)水平。然后構(gòu)建細(xì)胞連接圖進(jìn)行CCI分析，主要的分析方法包包括單細(xì)胞CCI推斷方法SoptSC（Wang等，2019d）、Scriabi（Wilk等，2024）；基于LR對(duì)的集群CCI方法NATMI（Hou等人，2020）、SingleCellSignalR（Cabello-Aguilar等人，2020）、scCrossTalk（Shao等人，2024）、CellPhoneDB（Efremova等人，2020）、Nichenet（Browaeys等人，2020）、CellChat（Jin等人） al., 2021）、CellCall（Zhang 等人，2021d）、ICELLNET（Noël 等人，2021）、 scMLnet（Cheng 等人，2021）、CytoTalk（Hu 等人，2021b）、Tensor-cell2cell（Armingol 等人，2022）、LRLoop（Xin 等人） 2022）；其他基于信息的聚類CCI方法有InterCellDB（Jin等，2022b）、EBOCOST（Zheng等，2022b）�；�于LR對(duì)的方法使用文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫整理或之前自我驗(yàn)證的LR對(duì)構(gòu)建數(shù)據(jù)庫：NATMI默認(rèn)使用connectomeDB2020數(shù)據(jù)庫（2,293個(gè)LR對(duì)中有1,751個(gè)來自作者在2015年驗(yàn)證的草圖）來構(gòu)建加權(quán)有向多邊網(wǎng)絡(luò)（Ramilowski等，2015）。CellPhoneDB提出了一種特定的SQLite數(shù)據(jù)庫來保留LR對(duì)的特定亞基架構(gòu)，使用平均表達(dá)閾值來確定相互作用的細(xì)胞，并使用幾何草圖子樣本框架來增強(qiáng)對(duì)大數(shù)據(jù)集的功效并排除噪音。同樣，ICELLNET利用異源復(fù)合物中配體與受體的多亞基結(jié)構(gòu)。NicheNet 在LR 先驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕喜捎没�于模型的參�?shù)優(yōu)化，通過添加細(xì)胞內(nèi)信號(hào)信息（靶基因）來優(yōu)化 CCI 強(qiáng)度，克服了上述方法直接用受體基因表達(dá)水平表示細(xì)胞內(nèi)受體蛋白數(shù)量以及結(jié)合下游信號(hào)通路與 GRN 改進(jìn) CCI 分析的問題。因此在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組 CCI 分析中，通常將 CellPhoneDB 與 NicheNet 結(jié)合使用以達(dá)到最佳分析效果（Dimitrov等，2022）。

最新的單細(xì)胞 CCI 方法采用了 DL 的策略，在一定程度上提高了應(yīng)用性能。DeepLinc 使用 VGAE 模型重建全范圍細(xì)胞間 CCI 網(wǎng)絡(luò)（Li and Yang, 2022）。TraSig 是一個(gè)連續(xù)狀態(tài)隱馬爾可夫模型，使用擬時(shí)序排序計(jì)算動(dòng)態(tài)交互分?jǐn)?shù)進(jìn)行 CCI 推斷（Li等，2022a）。此外，由于現(xiàn)在空間分辨的轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST)為基因信息提供了至關(guān)重要的空間信息，推斷空間細(xì)胞間通訊仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。SpaOTsc 可以重建 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的空間屬性，并依靠結(jié)構(gòu)化的最佳傳輸方法構(gòu)建 CCI 網(wǎng)絡(luò) ( Cang and Nie, 2020 )。Giotto 使用細(xì)胞間鄰近圖來推斷信號(hào)通路 ( Dries等，2021b )。然而，SpaOTsc 和 Giotto 都很難解析基于點(diǎn)的 ST 數(shù)據(jù)。最近，范實(shí)驗(yàn)室( Shao等，2022a )提出了 SpaTalk，它使用知識(shí)圖和圖網(wǎng)絡(luò)為單細(xì)胞和基于點(diǎn)的 ST 數(shù)據(jù)構(gòu)建空間相鄰細(xì)胞之間的配體-受體-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

（3）通路富集分析
基因通路富集分析是指以感興趣的基因作為前景基因與已知的特定數(shù)據(jù)庫關(guān)聯(lián)，建立基因-生物過程鏈路，用于解釋差異表達(dá)基因的生理功能、上下游通路等（Creixell等，2015）�；�因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）是首批提出用作富集分析的數(shù)據(jù)庫（Ashburner等，2000 ；Ogata等，1999）�；�因集富集分析（GSEA）是另一種廣泛使用的方法，通過計(jì)算富集得分來確定基因集S是否會(huì)在ranker DEGs列表L的兩側(cè)出現(xiàn)，以及顯著性檢驗(yàn)值（Subramanian等，2005）。Ingenuity 通路 Analysis (IPA)軟件中所有通路都經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與其他分析相比，它可以預(yù)測(cè)激活時(shí)整個(gè)通路的變化趨勢(shì)。其他常見的數(shù)據(jù)庫通路富集方法還包括過度表達(dá)分析（ORA）（Khatri等，2012）、基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涞姆治觯∟TA）（Wang等，2013）、Reactome基因集（Fabregat等，2018）、CORUM復(fù)合體（Ruepp等，2010）。參考數(shù)據(jù)集的來源通路和富集手段的差異會(huì)直接影響通路富集結(jié)果。為了方便分析，已經(jīng)提出了集成不同數(shù)據(jù)庫的基于Web的在線分析工具（Wang等，2017b ；Zhang等，2005）。Metascape涉及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（KEGG、GO、CORUM、TRRUST等）和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫（STRING、BioGrid、OmniPath等），共有25個(gè)數(shù)據(jù)庫可用于人類和小鼠等8個(gè)物種的遺傳和蛋白質(zhì)組富集分析（Zhou等，2019b）。

綜上所述，雖然我們列舉了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組下游分析最常見的部分（表 S3和S4），但仍然有很多方法沒有涉及到，包括基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析、免疫分析、細(xì)胞周期分配、基因變異探索、可變剪接分析等。總體而言，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析方法多種多樣且仍在不斷發(fā)展，所有分析方法的出發(fā)點(diǎn)和最終目的都是利用從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中精準(zhǔn)挖掘出的生物學(xué)信息進(jìn)行生物學(xué)解釋。

參考文獻(xiàn)：

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