線粒體不僅是細(xì)胞的能量工廠，還在細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和死亡中扮演著重要角色。線粒體電子流（Mito-EF）作為呼吸鏈中支持能量供應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，與腫瘤、炎癥和帕金森病等多種疾病的發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。不過(guò)盡管Mito-EF在調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞發(fā)育方面發(fā)揮重要作用，但由于缺乏專門的工具，它在線粒體質(zhì)量控制中的直接作用仍不明確。

由于電子作為基本粒子，缺乏化學(xué)可修飾特征，開(kāi)發(fā)Mito-EF的分子探針頗具挑戰(zhàn)性。不過(guò)它在線粒體電子傳遞鏈中的活性與質(zhì)子跨線粒體內(nèi)膜（IMM）轉(zhuǎn)移的速率密切相關(guān)，故監(jiān)測(cè)線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子變化可以反映Mito-EF的活性。然而，目前的質(zhì)子探針通常定位在細(xì)胞器基質(zhì)內(nèi)，這限制了它們的應(yīng)用。

為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，山東第一醫(yī)科大學(xué)陳啟鑫研究員領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出一種新型示蹤劑Mito-EFT，首次在單個(gè)線粒體水平觀察到Mito-EF，并監(jiān)測(cè)Mito-EF活性的動(dòng)態(tài)變化。這種示蹤劑為評(píng)估線粒體質(zhì)量和藥物篩選提供了有效工具。相關(guān)研究成果于2025年1月發(fā)表在《Advanced Science》雜志上。
 

研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員設(shè)計(jì)出一種Mito-EF示蹤劑（Mito-EFT），并利用來(lái)源于hUCMSC細(xì)胞的外泌體來(lái)包裝Mito-EFT。他們?cè)贖eLa細(xì)胞上開(kāi)展了多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞毒性分析、耗氧率測(cè)定、共定位分析等。利用結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM），他們觀察了線粒體的結(jié)構(gòu)和Mito-EFT的定位。他們還委托賽業(yè)生物敲除了HeLa細(xì)胞中的DRP1，以確定DRP1蛋白是否參與了Mito-EF重定位。

技術(shù)路線

設(shè)計(jì)Mito-EF特異性熒光探針，并評(píng)估其標(biāo)記Mito-EF的能力
↓
評(píng)估線粒體形態(tài)與Mito-EFT信號(hào)之間的關(guān)系，并分析線粒體動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中的Mito-EF分布
↓
探究DRP1蛋白是否參與Mito-EF重定位，以及如何調(diào)節(jié)Mito-EF活性
↓
設(shè)計(jì)基于Mito-EF的熒光成像藥物篩選方法，并在小分子藥物上進(jìn)行驗(yàn)證

研究結(jié)果
Mito-EF特異性熒光探針的設(shè)計(jì)
研究人員以香豆素為基本骨架，基于正電荷和二乙氨基等結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出Mito-EFT探針。這種探針被包裝在外泌體內(nèi)，以促進(jìn)跨膜遞送并最大限度地減少細(xì)胞膜的熒光干擾（圖1）。在正電荷的引導(dǎo)和線粒體膜電位的吸引下，探針到達(dá)并停留在線粒體內(nèi)膜上。通過(guò)二乙氨基對(duì)質(zhì)子的響應(yīng)，Mito-EFT探針可逆捕獲電子信號(hào)傳導(dǎo)，清晰地描繪出線粒體內(nèi)膜上的Mito-EF活性（圖1）。
 

圖1. 響應(yīng)線粒體電子流的熒光探針示意圖

他們發(fā)現(xiàn)，Mito-EFT對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性影響可忽略不計(jì)。在進(jìn)入細(xì)胞后，Mito-EFT利用其靶向線粒體嵴區(qū)域正電荷的能力，顯示出與線粒體特異性染料Mito-tracker的共定位。不過(guò)與Mito-tracker不同的是，Mito-EFT標(biāo)記的紅色顆粒表現(xiàn)出不均勻的分布。這種定位模式在不同的細(xì)胞系中保持一致。這些結(jié)果證實(shí)了Mito-EFT能夠準(zhǔn)確定位線粒體內(nèi)膜區(qū)域，對(duì)目標(biāo)測(cè)試對(duì)象做出響應(yīng)。此外，Seahorse分析也證實(shí)了Mito-EFT與Mito-EF的可逆結(jié)合。

Mito-EF集中在線粒體裂變和融合位點(diǎn)
接下來(lái)，研究人員探究了線粒體形態(tài)與Mito-EFT信號(hào)之間的關(guān)系。他們假設(shè)，Mito-EFT的異質(zhì)性分布可能與線粒體的形狀有關(guān)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，他們用Mito-EFT和Mito-tracker對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了雙重染色分析。他們觀察到，Mito-EFT標(biāo)記的熒光呈現(xiàn)出不規(guī)則分布。纖維狀健康線粒體內(nèi)的熒光信號(hào)更高，而甜甜圈樣和圓形受損線粒體內(nèi)的熒光分布較弱，表明受損線粒體的Mito-EF活性較低，而健康線粒體的Mito-EF活性較高。

為了探究線粒體動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中的Mito-EF分布，研究人員記錄了線粒體裂變和融合事件。值得注意的是，當(dāng)Mito-tracker標(biāo)記的單個(gè)線粒體分裂為兩個(gè)不同線粒體時(shí)，Mito-EF表現(xiàn)出不同的定位模式，其特點(diǎn)是信號(hào)集中在裂變位點(diǎn)（圖2A，紅色箭頭）。隨著裂變的進(jìn)行，Mito-EFT從非裂變區(qū)域轉(zhuǎn)移至裂變區(qū)域，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光積累。在裂變結(jié)束后，Mito-EF活性下降。在線粒體融合過(guò)程中，融合位點(diǎn)觀察到Mito-EF活性增強(qiáng)。這些結(jié)果證實(shí)，Mito-EF聚集在高活性區(qū)域，特別是線粒體裂變和融合位點(diǎn)，在線粒體質(zhì)量控制中發(fā)揮積極作用。
 

圖2. Mito-EF主要定位在線粒體裂變和融合位點(diǎn)

Mito-EF活性受到DRP1蛋白調(diào)控
眾所周知，參與線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵蛋白（比如DRP1）位于線粒體裂變位點(diǎn)，對(duì)線粒體穩(wěn)態(tài)有顯著影響。為了進(jìn)一步探究DRP1蛋白是否參與了Mito-EF重定位，研究人員委托賽業(yè)生物敲除了HeLa細(xì)胞中的DRP1。在DRP1-KO細(xì)胞中，線粒體表現(xiàn)出過(guò)度融合的纖維狀形態(tài)。同時(shí)，DRP1-KO細(xì)胞中Mito-EFT標(biāo)記的熒光信號(hào)顯著減少，而一些線粒體區(qū)域幾乎檢測(cè)不到Mito-EFT信號(hào)。這表明DRP1-KO改變了線粒體形態(tài)，并阻礙了Mito-EF的活性。

為了深入研究DRP1蛋白如何調(diào)控Mito-EF活性，他們假設(shè)DRP1的缺失可能會(huì)破壞線粒體嵴。他們觀察到，盡管傳統(tǒng)的形態(tài)評(píng)估工具顯示DRP1-KO線粒體向過(guò)度融合線粒體亞群轉(zhuǎn)變，但嵴結(jié)構(gòu)幾乎不存在。由此可見(jiàn)，觀察線粒體形態(tài)的傳統(tǒng)方法無(wú)法捕捉活細(xì)胞中的微小變化，在表征線粒體質(zhì)量和反映嵴結(jié)構(gòu)方面存在局限性。這些結(jié)果也支持了Mito-EF信號(hào)與線粒體嵴之間的關(guān)聯(lián)，突出了Mito-EFT探針作為線粒體質(zhì)量評(píng)估工具的潛力（圖3）。
 

圖3. 線粒體質(zhì)量評(píng)估流程的示意圖

將Mito-EF應(yīng)用于藥物篩選
考慮到形態(tài)學(xué)參數(shù)并不能反映線粒體內(nèi)部的真實(shí)活力，研究人員引入了一種Mito-EF驅(qū)動(dòng)的熒光成像藥物篩選方法。在使用一些代表性的氧化磷酸化抑制劑后，Mito-EFT表現(xiàn)出熒光抑制信號(hào)，其熒光變化與電子傳遞鏈的抑制順序密切相關(guān)。斑馬魚(yú)的成像實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了細(xì)胞成像結(jié)果。隨后，他們用這種方法篩選了13種小分子藥物。其中，木蘭花堿（Magnoflorine）對(duì)Mito-EFT的影響最為明顯，表明它有潛力作為線粒體靶向藥物�？傊�，他們引入了一種新型的藥物篩選方法（圖4）。

圖4. Mito-EF驅(qū)動(dòng)的熒光成像藥物篩選方法示意圖

結(jié)論
這項(xiàng)研究引入了一種新方法，有助于了解Mito-EF如何調(diào)節(jié)線粒體質(zhì)量控制。利用新開(kāi)發(fā)的Mito-EF示蹤劑，研究人員揭示了Mito-EF維持線粒體穩(wěn)態(tài)背后的動(dòng)態(tài)機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)加深了人們對(duì)Mito-EF動(dòng)態(tài)的了解，為探索控制線粒體功能的復(fù)雜機(jī)制開(kāi)辟了道路。這些研究還表明Mito-EFT是評(píng)估線粒體質(zhì)量的可靠指標(biāo)，優(yōu)于傳統(tǒng)的線粒體形態(tài)評(píng)估方法。

原文檢索
Ren Y, Wu LL, Song W, et al. Mitochondrial Electron Flow Dynamics Imaging for Assessing Mitochondrial Quality and Drug Screening. Adv Sci (Weinh). 2025 Jan 13: e2410561.