病毒轉(zhuǎn)染，是以病毒載體介導(dǎo)的一種高效的細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，其將外源基因包裝到病毒的外殼中，利用病毒的天然感染性，從而將外源基因?qū)�入宿主細胞�?dāng)中，使外源基因在細胞中穩(wěn)定表達。根據(jù)病毒載體不同，常見的分為腺病毒（Adenovirus，ADV）、慢病毒（Lentivirus，LV）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus，RV）、腺相關(guān)病毒（AAV）。目前實驗室用的比較多，使用范圍廣的是慢病毒，接下來，我們就講講慢病毒。

 

一 、慢病毒結(jié)構(gòu)

慢病毒是以HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，是一種有包膜的RNA病毒，直徑為80-120nm，呈二十面體對稱球形結(jié)構(gòu)。病毒顆粒最外層是包膜(包膜蛋白決定了感染細胞的類型)，往內(nèi)依次為基質(zhì)蛋白和衣殼，最里面是兩條相同的正股RNA鏈和一些酶，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶。

▲慢病毒結(jié)構(gòu)示意圖

 

慢病毒含有復(fù)雜的基因組。以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為例，HIV-1是一種單鏈RNA病毒，共有9個基因�；�因組兩端各有一個反向末端重復(fù)序列(LTR)，中間包括gag、 pol、env 3個編碼病毒的結(jié)構(gòu)基因，tat、rev2個調(diào)節(jié)基因， vif、vpr、vpu、nef 4 個輔助基因。隨著對慢病毒基因組的深入研究以及轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，人們對慢病毒基因組進行編輯，將其基因分布在不同的質(zhì)粒中，在安全性和包裝能力方面不斷改進，從而衍生了第一代、第二代、第三代慢病毒系統(tǒng)。其中第二代三質(zhì)粒系統(tǒng)和第三代的四質(zhì)粒系統(tǒng)是目前大家應(yīng)用比較多，比較廣的。以第二代的三質(zhì)粒系統(tǒng)為例，該系統(tǒng)包含1個包裝質(zhì)粒—編碼Gag、Pol、Rev 和Tat 基因, 產(chǎn)生病毒顆粒；一個包膜質(zhì)粒—Env或VSV-G表達病毒糖蛋白,提供受體結(jié)合蛋白；以及一個穿梭質(zhì)粒—帶有外源目的基因。下圖是第二代和第三代慢病毒質(zhì)粒包裝系統(tǒng)示意圖。

 

 

圖左：第二代慢病毒包裝系統(tǒng)示意圖

圖右：第三代慢病毒包裝系統(tǒng)示意圖

 

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https://www.addgene.org/guides/lentivirus/

 

二、慢病毒復(fù)制包裝

為了使靶細胞轉(zhuǎn)染效率更高，前期需要獲得高滴度的慢病毒，也就是需要進行慢病毒的復(fù)制包裝。通常情況下，將3質(zhì)粒按照一定比例添加，共同轉(zhuǎn)染到293T細胞中孵育，48-72小時后，將含有該病毒的上清液離心收集，或進一步濃縮病毒。

▲慢病毒結(jié)構(gòu)示意圖

 

三、慢病毒感染細胞過程

慢病毒感染細胞的第一步是通過其表面的包膜蛋白與宿主細胞吸附并與表面受體結(jié)合。與宿主細胞膜融合后，釋放病毒內(nèi)部的結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白以及病毒核心。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，慢病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄并與整合酶形成整合前復(fù)合物。隨之整合前復(fù)合物進入宿主細胞核后，整合酶催化其整合至宿主細胞基因組。最后外源基因前啟動子驅(qū)動其在宿主細胞質(zhì)中表達。

 

▲慢病毒感染宿主細胞示意圖

 

四、常見慢病毒轉(zhuǎn)染類型

1、慢病毒熒光轉(zhuǎn)染
細胞轉(zhuǎn)染一些標(biāo)記的熒光基團(GFP/mCherry/RFP等)，篩選出來的目的細胞帶有熒光蛋白。細胞在吸收熒光激發(fā)能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其恢復(fù)至基態(tài)時，以發(fā)射光形式釋放出能量，發(fā)射出一定波長的光�？梢酝ㄟ^倒置熒光顯微鏡或者流式細胞儀檢測其轉(zhuǎn)染后熒光強度來檢驗轉(zhuǎn)染效率。

 

2、慢病毒Luciferase化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)染

將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞或者導(dǎo)入研究動物體內(nèi)后，會產(chǎn)生熒光素酶(一種可以催化熒光素底物產(chǎn)生熒光的酶)。加入熒光素(底物)，在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素(底物)能夠被氧化發(fā)出綠色或黃色熒光。通過高靈敏生物發(fā)光成像技術(shù)檢測檢測光強度變化。尤其是檢測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移發(fā)展過程。

 

3、慢病毒細胞永生化轉(zhuǎn)染

體外分離培養(yǎng)的原代細胞，通過某種方法如病毒感染、輻射或者化學(xué)致癌作用，打破細胞原有的分裂次數(shù)限制，使其獲得一定分裂生長的能力，延緩細胞衰老死亡。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源性永生化基因?qū)�入目的細胞�?nèi)，從而獲得具有無限增殖能力且細胞間無差異的永生化細胞株。 

 

 

我們尚恩生物公司對常用的細胞系，原代細胞進行慢病毒轉(zhuǎn)染，包括細胞慢病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（ZsGreen）或者紅色熒光蛋白（mCherry、RFP）、細胞慢病毒轉(zhuǎn)染化學(xué)發(fā)光LUC、細胞慢病毒SV40永生化轉(zhuǎn)染，總共近40種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。也可以進行指定細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染。

 

 

左：HEK293-GFP-40X

右：143B-GFP-100X

左：HCT116-GFP-40X         

右：HUVEC SV40-GFP-100X

左：4T1-GFP-100X   

右：A549-RFP-100X

 

✔產(chǎn)品推薦

服務(wù) 編號	轉(zhuǎn)染類別	試驗?zāi)繕?biāo)	實驗 周期
SNTS-L001	GFP穩(wěn)轉(zhuǎn)	獲得GFP穩(wěn)定表達的細胞	3-4周
SNTS-L002	RFP穩(wěn)轉(zhuǎn)	獲得RFP穩(wěn)定表達的細胞	3-4周
SNTS-L003	mCherry穩(wěn)轉(zhuǎn)	獲得mCherry穩(wěn)定表達的細胞	3-4周
SNTS-L004	LUC穩(wěn)轉(zhuǎn)	獲得LUC穩(wěn)定表達的細胞	3-4周
SNTS-L005	SV40永生	獲得SV40永生化的細胞(以原代細胞為主)	6-8周