MeRIP-seq揭示衰老和神經(jīng)變性過程中m6A RNA甲基化修飾的保守下調(diào)機(jī)制
2023年02月22日，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》(Proc Natl Acad Sci USA)期刊發(fā)表了題為“Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts”的研究論文，該研究通過對(duì)小鼠和人的健康腦組織和AD（阿爾茨海默病，Alzheimer’s disease）患病腦組織進(jìn)行MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR等實(shí)驗(yàn)，揭示m6A修飾減少與突觸蛋白合成受損相關(guān)。
標(biāo)題：Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts（衰老和神經(jīng)變性過程中m6A RNA修飾減少與突觸轉(zhuǎn)錄本變化相關(guān)）
時(shí)間：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影響因子：IF 12.779
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
樣本實(shí)驗(yàn)：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）調(diào)控mRNA代謝。盡管已有研究表明m6A修飾與哺乳動(dòng)物大腦的發(fā)育和認(rèn)知相關(guān)，但m6A在突觸可塑性中（尤其是在認(rèn)知衰退期間）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）繪制了年輕（young）和老年（aged）小鼠海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回以及前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果表明老年小鼠的m6A水平降低。對(duì)認(rèn)知完整的健康人類和阿爾茨海默�。ˋD）患者的扣帶皮層（CC）腦組織的MeRIP-seq比較分析顯示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)老年小鼠和AD患者大腦常見的m6A變化，包括鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA選擇性谷氨酸受體1（Glua1），鄰近連接試驗(yàn)表明，m6A水平降低導(dǎo)致突觸蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）減少。此外m6A水平降低還會(huì)導(dǎo)致突觸功能受損。本研究結(jié)果表明，m6A RNA甲基化調(diào)控突觸蛋白合成，并可能在與衰老和AD相關(guān)的認(rèn)知衰退中發(fā)揮作用。
研究意義：
本研究描述了小鼠和人類的健康和AD患病大腦中的全基因組m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。數(shù)據(jù)分析表明，大量的m6A轉(zhuǎn)錄本保守，且這些轉(zhuǎn)錄本集中在突觸處富集、與突觸過程的調(diào)控有關(guān)。研究人員在AD小鼠模型的腦組織和患有阿爾茨海默病患者的扣帶回腦組織中檢測(cè)到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在機(jī)制水平上證明了m6A修飾減少與受損的突觸蛋白合成相關(guān)。
結(jié)果圖形
（1）成年小鼠大腦中的m6A圖譜
本研究通過表征健康成年小鼠大腦中m6A RNA修飾圖譜來(lái)開始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月齡（young）野生型（WT）小鼠的大腦，以獲得海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回（DG）以及前扣帶皮層（ACC），實(shí)驗(yàn)所用樣本與學(xué)習(xí)和記憶過程以及認(rèn)知疾病有關(guān)。對(duì)樣本進(jìn)行甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）以鑒定年輕成年小鼠的亞區(qū)域特異性表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。
圖1：成年小鼠大腦的m6A RNA甲基化圖譜。
這些數(shù)據(jù)表明常見的m6A轉(zhuǎn)錄本可能在突觸處特異性富集，為了進(jìn)一步深入研究，作者利用最近發(fā)表的包含高可信度的海馬突觸RNAome數(shù)據(jù)集，并將其與海馬表觀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中觀察到突觸在mRNA中甲基化轉(zhuǎn)錄本中的強(qiáng)富集，超過70%的突觸體和64%的微流體室轉(zhuǎn)錄組中至少有一個(gè)m6A peaks�；诒狙芯繑�(shù)據(jù)列表與其他數(shù)據(jù)庫(kù)的交叉比較分析，表明m6A RNA修飾是成年大腦突觸功能的關(guān)鍵調(diào)控過程。
（2）成年人腦中的m6A甲基化修飾揭示了與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本保守富集
接下來(lái)，作者對(duì)5個(gè)死后認(rèn)知未衰退健康人腦的扣帶皮層（CC）組織進(jìn)行MeRIP-seq，以描繪人腦轉(zhuǎn)錄本中的m6A分布。
（3）小鼠認(rèn)知衰退模型和人類AD患者腦組織中的m6A RNA變化
通過MeRIP-seq數(shù)據(jù)證明了通過m6A修飾調(diào)控突觸組織、功能和可塑性可能是成年哺乳動(dòng)物大腦中的保守機(jī)制。為了進(jìn)一步探索這一點(diǎn)，作者選擇鼠年齡相關(guān)記憶障礙作為認(rèn)知衰退模型系統(tǒng)研究了m6A修飾變化機(jī)制。
圖4：表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在神經(jīng)變性和衰老中的變化。
（4）m6A水平降低影響可塑相關(guān)蛋白CAMKII的合成
本研究通過MeRIP-seq等實(shí)驗(yàn)闡明了m6A RNA修飾在年輕和老年小鼠大腦以及認(rèn)知完整的人類和AD患者大腦中的功能，為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了重要資源。由于在大腦衰老和AD中觀察到突觸基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化機(jī)制可能是預(yù)防認(rèn)知衰退的頗具前景的策略。
參考文獻(xiàn)：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
時(shí)間：2023.02.22
期刊：Proc Natl Acad Sci USA
影響因子：IF 12.779
技術(shù)平臺(tái)：MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、Polysome-seq、H3K36me3 ChIP-seq等
樣本實(shí)驗(yàn)：
研究摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）調(diào)控mRNA代謝。盡管已有研究表明m6A修飾與哺乳動(dòng)物大腦的發(fā)育和認(rèn)知相關(guān)，但m6A在突觸可塑性中（尤其是在認(rèn)知衰退期間）的作用尚未完全了解。本研究采用甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）繪制了年輕（young）和老年（aged）小鼠海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回以及前扣帶皮層（anterior cingulate cortex，ACC）的m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果表明老年小鼠的m6A水平降低。對(duì)認(rèn)知完整的健康人類和阿爾茨海默�。ˋD）患者的扣帶皮層（CC）腦組織的MeRIP-seq比較分析顯示，AD患者中m6A RNA甲基化水平降低。在與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)老年小鼠和AD患者大腦常見的m6A變化，包括鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2（CAMKII）和AMPA選擇性谷氨酸受體1（Glua1），鄰近連接試驗(yàn)表明，m6A水平降低導(dǎo)致突觸蛋白合成（如CAMKII和GLUA1）減少。此外m6A水平降低還會(huì)導(dǎo)致突觸功能受損。本研究結(jié)果表明，m6A RNA甲基化調(diào)控突觸蛋白合成，并可能在與衰老和AD相關(guān)的認(rèn)知衰退中發(fā)揮作用。
研究意義：
本研究描述了小鼠和人類的健康和AD患病大腦中的全基因組m6A表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。數(shù)據(jù)分析表明，大量的m6A轉(zhuǎn)錄本保守，且這些轉(zhuǎn)錄本集中在突觸處富集、與突觸過程的調(diào)控有關(guān)。研究人員在AD小鼠模型的腦組織和患有阿爾茨海默病患者的扣帶回腦組織中檢測(cè)到m6A RNA甲基化水平降低。本研究在機(jī)制水平上證明了m6A修飾減少與受損的突觸蛋白合成相關(guān)。
結(jié)果圖形
（1）成年小鼠大腦中的m6A圖譜
本研究通過表征健康成年小鼠大腦中m6A RNA修飾圖譜來(lái)開始分析。提取并解剖了十只（C57BL/6J）3月齡（young）野生型（WT）小鼠的大腦，以獲得海馬亞區(qū)CA1、CA3和齒狀回（DG）以及前扣帶皮層（ACC），實(shí)驗(yàn)所用樣本與學(xué)習(xí)和記憶過程以及認(rèn)知疾病有關(guān)。對(duì)樣本進(jìn)行甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）以鑒定年輕成年小鼠的亞區(qū)域特異性表觀轉(zhuǎn)錄組圖譜。
圖1：成年小鼠大腦的m6A RNA甲基化圖譜。
- 實(shí)驗(yàn)方案。
- 上：根據(jù)input計(jì)算海馬CA1、CA3和DG區(qū)域中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖。下：注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域的m6A peaks位點(diǎn)。百分比由m6A peaks總數(shù)計(jì)算。
- 海馬亞區(qū)mRNA上m6A peaks分布吉他圖。
- 海馬亞區(qū)m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖。
- 所有海馬區(qū)域中檢測(cè)到的m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本GO富集分析
- 上：在ACC轉(zhuǎn)錄組中m6A RNA甲基化的分布。下：注釋的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域的m6A peaks位點(diǎn)。
- ACC中mRNA的m6A peaks分布吉他圖
- 比較海馬和ACC中m6A常見甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖。
- 海馬和ACC中常見m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本中突觸特異性GO富集分析Sunburst圖。
- 從海馬突觸體或從微流體室（microfluid chamber）中分離突觸中獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)集中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖。ACC-前扣帶皮層，DG-齒狀回，5‘UTR-5'非翻譯區(qū)，3’UTR-3'非翻譯區(qū)，CDS-編碼序列，ncRNA-非編碼RNA。
這些數(shù)據(jù)表明常見的m6A轉(zhuǎn)錄本可能在突觸處特異性富集，為了進(jìn)一步深入研究，作者利用最近發(fā)表的包含高可信度的海馬突觸RNAome數(shù)據(jù)集，并將其與海馬表觀轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。在這兩個(gè)數(shù)據(jù)集中觀察到突觸在mRNA中甲基化轉(zhuǎn)錄本中的強(qiáng)富集，超過70%的突觸體和64%的微流體室轉(zhuǎn)錄組中至少有一個(gè)m6A peaks�；诒狙芯繑�(shù)據(jù)列表與其他數(shù)據(jù)庫(kù)的交叉比較分析，表明m6A RNA修飾是成年大腦突觸功能的關(guān)鍵調(diào)控過程。
（2）成年人腦中的m6A甲基化修飾揭示了與突觸功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本保守富集
接下來(lái)，作者對(duì)5個(gè)死后認(rèn)知未衰退健康人腦的扣帶皮層（CC）組織進(jìn)行MeRIP-seq，以描繪人腦轉(zhuǎn)錄本中的m6A分布。
圖2：小鼠和人之間保守的m6A修飾。
- 上：根據(jù)input計(jì)算人CC中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖。下圖：注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)域m6A peaks位點(diǎn)。
- 人CC中mRNA上m6A修飾分布吉他圖
- m6A peaks的motif分析鑒定出m6A DRACH共有motif（D=A、T或G，R=A或G，H=A、T或C）。
- 左：分別在人/小鼠中已知同源物的小鼠/人基因Doughnut圖，用于比較不同物種的甲基化轉(zhuǎn)錄本。右：比較成年小鼠ACC和人CC中m6A甲基化同源轉(zhuǎn)錄本的Venn圖。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本的GO分析（生物學(xué)過程）。
- 小鼠ACC和人CC共有m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本GO富集分析的突觸特異性Sunburst圖。
- 在小鼠ACC和人CC（CAMKIIb/CAMKIIb）中的Camk2b沿同源轉(zhuǎn)錄本3'端保守的m6A修飾代表性覆蓋軌跡。軌跡根據(jù)相應(yīng)input和文庫(kù)大小歸一化的m6A RIP覆蓋值。以RPM為單位刻度。
- 人CC特異性m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本的GO分析。
- 與突觸RNA相比，保守轉(zhuǎn)錄本（通常在小鼠和人類中檢測(cè)到）與人和小鼠特異性轉(zhuǎn)錄本之間相關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢(shì)比熱圖。
（3）小鼠認(rèn)知衰退模型和人類AD患者腦組織中的m6A RNA變化
通過MeRIP-seq數(shù)據(jù)證明了通過m6A修飾調(diào)控突觸組織、功能和可塑性可能是成年哺乳動(dòng)物大腦中的保守機(jī)制。為了進(jìn)一步探索這一點(diǎn)，作者選擇鼠年齡相關(guān)記憶障礙作為認(rèn)知衰退模型系統(tǒng)研究了m6A修飾變化機(jī)制。
圖3：老年小鼠大腦中的組織特異性m6A變化
- 實(shí)驗(yàn)方案。
- 在相應(yīng)的腦亞區(qū)中檢測(cè)到的差異表達(dá)和差異甲基化基因數(shù)量條形圖，對(duì)FC和調(diào)整后的P值應(yīng)用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 在分析的大腦亞區(qū)中m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本百分比餅圖，其中包含在衰老過程中僅甲基化水平降低（低甲基化）和僅甲基化水平增加（高甲基化）的peaks，或m6A peaks減少和增加（混合）的混合peaks。
- 所研究大腦區(qū)域轉(zhuǎn)錄本中顯著低甲基化m6A peaks的注釋分布條形圖。
- 比較海馬亞區(qū)和ACC的低甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖。深紅色矩形表示在所有海馬亞區(qū)檢測(cè)到的87個(gè)轉(zhuǎn)錄本。相應(yīng)的右/上圖顯示了這些轉(zhuǎn)錄本的GO富集分析（生物過程）。黑色矩形表示海馬和ACC中通常低甲基化的33個(gè)轉(zhuǎn)錄本，右/下圖顯示了相應(yīng)的GO富集分析。
- 兩個(gè)差異甲基化基因（低甲基化和高甲基化）的qPCR驗(yàn)證。圖中顯示了MeRIP-seq和MeRIP–qPCR檢測(cè)到的甲基化FC。MeRIP-seq數(shù)據(jù)列表顯示了FDR的平均FC，由ExomePeak計(jì)算。MeRIP-qPCR數(shù)據(jù)列表顯示了每個(gè)條件四個(gè)獨(dú)立重復(fù)的平均值±SEM。統(tǒng)計(jì)顯著性由Student's t檢驗(yàn)確定，P值顯示在比較值上方。
圖4：表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在神經(jīng)變性和衰老中的變化。
- AD組與對(duì)照組樣品中差異表達(dá)和差異m6A甲基化轉(zhuǎn)錄本數(shù)量條形圖，對(duì)FC和調(diào)整后的P值應(yīng)用相同的截止值（FC>1.2，padj≤0.05）。
- 與對(duì)照組相比，AD樣本中低甲基化、高甲基化和混合轉(zhuǎn)錄本的比例餅圖。
- 與對(duì)照組相比，AD中m6A低甲基化轉(zhuǎn)錄本（FC>1.5）的GO富集分析。
- AD中低甲基化轉(zhuǎn)錄本m6A peaks分布條形圖。
- 比較老年小鼠ACC和人AD患者CC中顯著低甲基化轉(zhuǎn)錄本Venn圖，突出顯示的是CaMKII亞型。
- KEGG通路LTP圖（hsa04720）。紫色突出顯示的是AD患者的老年小鼠ACC和人CC中通常低甲基化的轉(zhuǎn)錄本。CAMKII也屬于該組，但由于其低甲基化通過qPCR（H）驗(yàn)證，因此以紅色突出顯示。
- 在年輕與老年小鼠、健康對(duì)照與AD患者中的人CC大腦中CamkII亞型的m6A低甲基化條形圖。每條代表最接近終止密碼子的相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的3‘UTR中的甲基化位點(diǎn)。
- qPCR驗(yàn)證不同CamkII亞型的3‘UTR中低甲基化區(qū)域。圖中顯示通過MeRIP-seq和MeRIP-qPCR檢測(cè)的m6A甲基化中的FC。誤差條顯示6/4（young/aged）獨(dú)立重復(fù)的平均值±SEM；P值顯示在比較上方。統(tǒng)計(jì)顯著性通過Student's t檢驗(yàn)和Welch對(duì)不等方差的校正進(jìn)行評(píng)估。
（4）m6A水平降低影響可塑相關(guān)蛋白CAMKII的合成
圖5：m6A水平變化影響CAMKII突觸蛋白合成
- 用靶向Mettl3（Mettl3 KD）或相應(yīng)對(duì)照寡核苷酸（對(duì)照）的GAPmer處理神經(jīng)元培養(yǎng)物中Mettl3表達(dá)的qPCR結(jié)果條形圖。
- 代表性的immunoblot分析顯示METTL3蛋白水平響應(yīng)于GAPmer介導(dǎo)的METTL3敲除。
- B的量化。
- GAPmer介導(dǎo)的Mettl3敲除后的主要m6A水平。A、C和D中的圖表顯示了每個(gè)條件的平均值±SEM。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立的復(fù)制。
- 用于量化原代神經(jīng)元中CAMKII合成的puro-PLA標(biāo)記示意圖。
- 用對(duì)照或Mettl3 KD GAPmers處理的原代海馬神經(jīng)元的代表性圖像。（比例尺，20μm）CAMKII-PLA信號(hào)顯示為綠色，SYP顯示為紅色，Map2顯示為藍(lán)色。右圖顯示了代表性樹突的高倍圖像（比例尺，10μm）。箭頭表示突觸附近的CAMKII合成位點(diǎn)。
- 處理的神經(jīng)元中檢測(cè)到的PLA點(diǎn)總數(shù)的Violin圖。陰性對(duì)照（NegC）在PLA前未經(jīng)嘌呤霉素處理。
- 比較對(duì)照和Mettl3 KD處理的神經(jīng)元中突觸定位的CAMKII-PLA點(diǎn)的Violin圖。G和H中的圖顯示三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值；每個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)7-13個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行成像和分析。四分位數(shù)用灰線標(biāo)記。
- 微流體室中生長(zhǎng)的原代神經(jīng)元突觸室中歸一化CAMKIIa mRNA水平。I中的點(diǎn)代表神經(jīng)元培養(yǎng)體的獨(dú)立重復(fù)。
本研究通過MeRIP-seq等實(shí)驗(yàn)闡明了m6A RNA修飾在年輕和老年小鼠大腦以及認(rèn)知完整的人類和AD患者大腦中的功能，為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了重要資源。由于在大腦衰老和AD中觀察到突觸基因的m6A RNA甲基化降低，因此靶向m6A RNA甲基化機(jī)制可能是預(yù)防認(rèn)知衰退的頗具前景的策略。
參考文獻(xiàn)：
Castro-Hernández R,et al. Conserved reduction of m6A RNA modifications during aging and neurodegeneration is linked to changes in synaptic transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Feb 28;120(9):e2204933120.
- 時(shí)空組學(xué)研究進(jìn)展（二)：?jiǎn)渭?xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的分析方法
- 時(shí)空組學(xué)研究進(jìn)展（一）：?jiǎn)渭?xì)胞RNA測(cè)序的流程與技術(shù)
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