據(jù)統(tǒng)計，當今世界約有8億精神疾病患者，而這一數(shù)字還在持續(xù)增長。精神疾病的癥狀嚴重影響著病人的生活，致使他們經(jīng)常被污名化，他們的自殺風險估計至少比普通公眾高十倍。

對于科學家來說，精神疾病的異質性也給研究帶來了不小的挑戰(zhàn)：具有相同診斷的患者在癥狀、治療藥物和基因方面表現(xiàn)出極大的差異。因此，深入了解這些疾病的細胞和分子結構不僅對理解該疾病至關重要，而且對它們的發(fā)展和治療也至關重要。

本期推送為大家?guī)�來一篇關于精神分裂癥（Scz）的研究論文，該研究利用單細胞測序等技術深入研究了Scz的神經(jīng)發(fā)育途徑。

基本信息

文章題目：Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids

發(fā)表時間：2022年3月

發(fā)表期刊：MOL PSYCHIATR（IF=15.992）

關鍵詞：神經(jīng)分裂癥，單細胞轉錄組學，蛋白質組學

研究方法：高通量流式細胞術，液相色譜-質譜（LC/MS），scRNA-seq，激光掃描共焦顯微鏡

發(fā)表單位：美國康奈爾大學醫(yī)學院

文章摘要 

研究利用患者源性誘導多能干細胞（iPSCs）生成3D類腦器官來模擬在這一關鍵時期精神分裂癥（Scz）的神經(jīng)病理學。

研究者發(fā)現(xiàn)Scz類器官表現(xiàn)出腦室神經(jīng)病理學，導致祖細胞存活率改變和神經(jīng)發(fā)生中斷。這最終在Scz類器官發(fā)育的皮質區(qū)內(nèi)產(chǎn)生較少的神經(jīng)元。單細胞測序顯示，Scz祖細胞特異性缺乏神經(jīng)元編程因子，導致細胞譜系重塑、分化軌跡改變和皮質細胞類型多樣性扭曲。雖然Scz類器官的大分子多樣性與健康對照（CTRL）產(chǎn)生的類器官相似，但四種GWAS因子（PTN、COMT、PLCL1和PODXL）和屬于POU域轉錄因子家族的肽片段（例如POU3F2/BRN2）發(fā)生了改變。這表明，Scz類器官的主要差異不在于其蛋白質組多樣性，而在于其在分子水平上的疾病總量和神經(jīng)發(fā)育因子。隨后，單細胞測序確定了神經(jīng)元編程因子的細胞類型特異性改變以及神經(jīng)營養(yǎng)生長因子表達的發(fā)育開關，表明Scz神經(jīng)病理學可以在細胞類型的基礎上進行編碼。此外，單細胞測序還特異性復制了Scz祖細胞和神經(jīng)元中BRN2（POU3F2）和PTN的缺失。隨后，在兩個挽救實驗中，發(fā)現(xiàn)轉錄因子BRN2和生長因子PTN分別作為Scz類器官中神經(jīng)發(fā)生和細胞存活的機制性底物。

總之，研究表明，Scz的多種機制存在于患者衍生的類器官中，并且這些不同的機制集中于原始的大腦發(fā)育途徑，如神經(jīng)元分化、存活和生長因子支持，這些途徑可能合并以提高Scz的內(nèi)在風險。

研究結果 

■患者源性Scz類器官表現(xiàn)出腦室熵和神經(jīng)病理學特征

首先，研究者采用了一種無形態(tài)因子的類器官方案，可包含感興趣的細胞類型，同時避免了外源性形態(tài)因子暴露導致的潛在混雜效應。因此，從健康對照組和特發(fā)性Scz患者中生成3D大腦類器官。利用免疫組化和激光共聚焦顯微鏡技術發(fā)現(xiàn)，與對照類器官相似，Scz類器官也表現(xiàn)出廣泛的神經(jīng)誘導，其特征是NESTIN+纖維和SOX2+前體細胞富集的腦室區(qū)域的存在（圖1b）。然而，Scz比對照的腦室區(qū)域更小，充滿神經(jīng)元的皮質區(qū)也更稀疏，表明Scz祖細胞可能過早死亡或無法啟動神經(jīng)發(fā)生。對iPSC供體的祖細胞死亡分析發(fā)現(xiàn)Scz腦室祖細胞死亡顯著增加，且其皮質區(qū)內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（圖1c和d）。通過BrdU脈沖追蹤實驗發(fā)現(xiàn)在相同的區(qū)域里，經(jīng)歷神經(jīng)元分化或祖細胞自我更新的BrdU+增殖祖細胞的比例。在對照類器官中，祖細胞在追蹤期間主要分化為早期的神經(jīng)元，而Scz則表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)發(fā)生障礙（圖1e）。綜上所述，Scz類器官中的神經(jīng)元丟失是由細胞凋亡增加和神經(jīng)發(fā)生減少的共同作用引起的。

● 圖1 Scz患者源性類器官中的腦室祖細胞被破壞

■ 患者源性Scz類器官表現(xiàn)出腦室熵和神經(jīng)病理學特征

為了繪制3D人衍生類器官的蛋白質組，研究采用串聯(lián)質量標記（TMT）技術對從對照和Scz大腦類器官中分離的肽進行全局條形碼標記，可進行定量液相色譜-質譜分析（LC-MS）（圖2a）。該方法鑒定了3772個蛋白質。研究發(fā)現(xiàn)，對照和Scz大腦類器官之間的蛋白幾乎完全重疊，只有兩種蛋白是Scz腦類器官所特有的（圖2b）。因此，盡管非定向性大腦類器官的形態(tài)和外觀各不相同，但其大分子組成相對穩(wěn)定且一致。此外，對照和Scz大腦類器官均表現(xiàn)出豐富的神經(jīng)元和大腦發(fā)育途徑。雖然對照和Scz中蛋白質的多樣性非常相似，但進一步的計算分析表明，Scz中的多肽數(shù)量存在顯著差異。222種蛋白質在對照和Scz類器官之間的表達存在差異（圖2d）。有趣的是，在Scz類器官中鑒定出含有POU結構域轉錄因子的肽片段。結合前人的Scz基因關聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)至少約有70種可能的危險蛋白存在與類器官，其中PLCL1、PTN、PODXL和COMT，在Scz類器官中顯著差異表達（圖2e）。這表明Scz的神經(jīng)病理學主要與具有既定疾病風險的常見分子因素的破壞有關，這可能是更廣泛的調(diào)控網(wǎng)絡共同破壞的結果。

● 圖2 蛋白質組學和單細胞轉錄組學鑒定了Scz患者類器官的新疾病特征

■ 單細胞測序顯示Scz類器官中異常的細胞類型多樣性

為了更好地觀察SZ中被破壞的特定細胞類型，研究使用高通量流式細胞術及Chromium single cell 3’平臺進行了單細胞RNA測序（scRNA-seq），以表征皮層細胞類型的多樣性（圖2f）。與早期的發(fā)現(xiàn)相一致的是，與對照組相比，Scz的神經(jīng)元和祖細胞豐度減少，然而Scz表現(xiàn)出幾種腦相關細胞類型（神經(jīng)內(nèi)皮細胞、髓樣細胞等）的異常富集，雖然對照結果中也有這些細胞類型但豐度較低。

■ 擬時分析揭示了Scz類器官細胞譜系的重塑

接下來，研究人員使用scRNA-seq數(shù)據(jù)進行擬時分析，來推斷發(fā)育過程細胞的分化軌跡或細胞亞型的演化過程（圖3a）。利用這些方法，發(fā)現(xiàn)對照類器官反映了已知神經(jīng)元編程因子的富集，而Scz類器官則由與多能性、細胞骨架細絲和神經(jīng)內(nèi)皮細胞相關的標志物定義。在祖細胞和神經(jīng)元cluster中的異常標志物過多，損害了其他原型神經(jīng)元發(fā)育因子和相關的細胞類型。擬時序分析結果表明Scz細胞譜系重塑，即在類器官里從神經(jīng)元產(chǎn)生中將祖細胞分化轉移出來。

■ SCZ祖細胞和神經(jīng)元中神經(jīng)病理的細胞特異性編碼

許多轉錄分化調(diào)節(jié)因子在Scz祖細胞中下調(diào)，包括軸突發(fā)育途徑因子的耗竭（圖3b）。NT-3或NTF3在Scz祖細胞中表達下調(diào)。與擬時序分析一致，Scz祖細胞表現(xiàn)出結構、細絲、黏附和血管生成途徑的異常富集，說明這些祖細胞缺乏一系列促進神經(jīng)元分化和促進神經(jīng)元早期發(fā)育的因子。在Scz發(fā)育中的神經(jīng)元里，與祖細胞類似，一些神經(jīng)發(fā)育因子、神經(jīng)絲因子和指導因子的表達下調(diào)。奇怪的是，研究者發(fā)現(xiàn)Scz神經(jīng)元中PI3K-Akt信號和生長因子結合途徑的富集，包括TrkA(NTRK1)受體的下調(diào)和神經(jīng)營養(yǎng)素切割因子FURIN的上調(diào)。根據(jù)相互作用模型，Scz神經(jīng)元中上調(diào)的IL6ST可能位于FURIN和TrkA的下游（圖3d）。Scz祖細胞的NT-3和神經(jīng)元中的TrkA下調(diào)表明可能存在其他神經(jīng)營養(yǎng)因子功能障礙的離散模式。更深層的假設驅動分析顯示Scz祖細胞也傾向于下調(diào)BDNF但上調(diào)NT-4基因的表達，而TrkB(NTRK2)是祖細胞中唯一下調(diào)的神經(jīng)營養(yǎng)素受體（圖3e）。與此相反，Scz神經(jīng)元只有TrkA的細胞特異性下調(diào)。綜上所述，研究者假設在Scz類器官中，不同的細胞特異性神經(jīng)病理可能匯聚在共同的通路上，導致祖細胞和神經(jīng)元之間相關但不重疊的Scz細胞特異性神經(jīng)病理。

● 圖3 Scz類器官的細胞譜系改變和細胞特異性神經(jīng)病理學

■ 確定BRN2和PTN為類器官的候選疾病因子

為了確定患者來源的類器官中Scz神經(jīng)病理學的潛在機制因素，研究者確定了蛋白質組靶點是否可以在scRNA-seq轉錄組數(shù)據(jù)集中得到驗證。進一步對數(shù)據(jù)進行分析，研究人員觀察到在Scz樣品中BRN2（增加了胚胎發(fā)育中后期神經(jīng)元的產(chǎn)生）和PTN（靠近GWAS鑒定的Scz相關位點，也促進了細胞的存活以及其他神經(jīng)發(fā)育過程）的缺失（圖3f和g）。BRN2是一種前腦特異性轉錄因子，在哺乳動物腦中的神經(jīng)前體細胞和遷移神經(jīng)元中表達，并在早期皮質神經(jīng)發(fā)生中發(fā)揮功能作用，可能是Scz神經(jīng)病理的下游病理生理學底物。BRN2在Scz類器官中的表達增加導致晚期神經(jīng)元數(shù)量增加，但對祖細胞死亡沒有影響，說明BRN2參與Scz類器官的神經(jīng)元分化但不參與細胞凋亡。PTN被認為通過促進神經(jīng)元分化在早期皮質新生中發(fā)揮作用。用PTN處理Scz類器官發(fā)現(xiàn)細胞凋亡顯著減少，新生細胞存活率提高，從而顯著增加神經(jīng)元分化，說明PTN可通過同時促進神經(jīng)發(fā)生和抑制凋亡來調(diào)節(jié)新生細胞的存活，從而調(diào)節(jié)Scz腦類器官中的神經(jīng)元數(shù)量。利用BrainCloudTM數(shù)據(jù)庫進一步挖掘信息發(fā)現(xiàn)BRN2和PTN在產(chǎn)前人腦發(fā)育期間表現(xiàn)出峰值表達，說明它們可能是在這一時期與Scz風險有關的胚胎靶點。

總結 

研究分析了Scz患者來源的3D類器官細胞特異性神經(jīng)病理和多種機制，從而揭示了獨特的發(fā)育途徑和新的疾病因素機制，這些可能導致在早期皮質生成中Scz的風險。