研究背景

目前m6A修飾的研究如火如荼，共計(jì)發(fā)表文章已達(dá)3000+篇，且每年仍呈指數(shù)上漲的趨勢(shì)。針對(duì)m6A的研究主要包括兩大方面：（1）編碼RNA上m6A修飾調(diào)控表達(dá)；（2）非編碼RNA（包括lncRNA、circRNA、miRNA等）中m6A修飾調(diào)控下游表達(dá)。然而非編碼RNA發(fā)表的文獻(xiàn)還較少，目前針對(duì)非編碼RNA的研究仍具有非常廣闊的空間。云序生物現(xiàn)已發(fā)表多篇非編碼RNA研究文章，這次我們以云序客戶發(fā)表的circRNA+m6A方向文章為例，幫助老師掌握短平快發(fā)表5分circRNA修飾譜學(xué)文章思路。
 
案例解析
  發(fā)表期刊：Journal of Cellular and Molecular Medicine
發(fā)表日期：2021年6月27日
影響因子：5.109
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Identification and characterization of N6-methyladenosine modification of circRNAs in glioblastoma
實(shí)驗(yàn)背景：
膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的腦腫瘤，約占所有原發(fā)性腦腫瘤的80%。最近的表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，RNA轉(zhuǎn)錄后修飾在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝以及腫瘤的生物學(xué)行為中起著至關(guān)重要的作用。然而circRNA的m6A修飾在GBM發(fā)病機(jī)制中的作用仍然不清楚。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
本文通過(guò)m6A MeRIP-seq結(jié)合RNA-seq，分析了環(huán)狀RNA中m6A修飾在膠質(zhì)瘤發(fā)展進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制。本文思路設(shè)計(jì)如下：
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
（1）甲基化水平整體分析 （2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發(fā)生差異甲基化修飾的circRNA，采用散點(diǎn)圖展示了差異甲基化修飾的circRNA。此外也分別展示了差異峰所在circRNA的基因組分布、長(zhǎng)度分布以及染色體分布等信息。
  （3）m6A MeRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析
通過(guò)兩組學(xué)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)在m6A修飾水平改變的基因中，有1298個(gè)表達(dá)上調(diào)，1905個(gè)下調(diào)。且m6A水平與circRNA表達(dá)呈正相關(guān)。分別采用散點(diǎn)圖、熱圖等展示了既發(fā)生差異甲基化又發(fā)生差異表達(dá)的基因。
  （4）功能富集分析
分別對(duì)差異（上調(diào)或下調(diào)）的甲基化circRNA的來(lái)源基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，從而從生物學(xué)功能的方向找出m6A修飾circRNA可能參與的功能通路，從生物學(xué)功能的角度解析m6A修飾circRNA對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)程的調(diào)控。
  （5）指標(biāo)驗(yàn)證
此外，本文通過(guò)MeRIP-qPCR驗(yàn)證并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)鑒定了5個(gè)相關(guān)分子（BUB1、C1S、DTHD1、F13A1和NDC80），這些分子可能是進(jìn)一步研究m6A介導(dǎo)GBM發(fā)展的功能和機(jī)制的初步候選分子。
    發(fā)表期刊：BMC Genomics
發(fā)表日期：2020年1月13日
影響因子：3.969
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq（云序提供）
文章鏈接：Transcriptome-wide map of m6A circRNAs identified in a rat model of hypoxia mediated pulmonary hypertension
實(shí)驗(yàn)背景：
低氧介導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓（HPH）是一種致命性疾病，目前尚無(wú)有效的治療方法。近期研究發(fā)現(xiàn)circRNA受m6A修飾的調(diào)控，而circRNA的m6A修飾在HPH中作用仍不清楚。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
本文通過(guò)m6A MeRIP-seq結(jié)合RNA-seq，分析了環(huán)狀RNA中m6A修飾在HPH中的調(diào)控機(jī)制。本文思路設(shè)計(jì)如下： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
（1）甲基化水平整體分析
m6A MeRIP-seq測(cè)序后采用熱圖展示了每個(gè)樣品中基因甲基化修飾水平，箱圖從整體上展示了正常組樣品和HPH組樣品中的甲基化水平。m6A修飾在環(huán)狀RNA類(lèi)型上的偏好性以及每個(gè)circRNA外顯子上m6A修飾的位點(diǎn)數(shù)也做了餅圖和柱狀圖的展示。這部分結(jié)果從整體上展示了正常組織和HPH組織circRNA上m6A的修飾情況，為后續(xù)研究進(jìn)行鋪墊。

（2）差異甲基化分析
分析比較兩組間發(fā)生差異甲基化修飾的circRNA，針對(duì)上調(diào)、下調(diào)相關(guān)circRNA進(jìn)行長(zhǎng)度及染色體分布特征分析，并分別用韋恩圖、散點(diǎn)圖以及累計(jì)分布圖展示了兩組間差異甲基化修飾情況。為篩選靶標(biāo)基因提供基礎(chǔ)。 （3）m6A MeRIP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析
通過(guò)兩組學(xué)聯(lián)合分析采用散點(diǎn)圖展示了既發(fā)生差異甲基化又發(fā)生差異表達(dá)的基因情況。針對(duì)上述circRNA來(lái)源基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，將m6A修飾差異且表達(dá)差異的circRNA來(lái)源基因轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)意義的通路富集基因，從而進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行了解，有利于后續(xù)指標(biāo)的篩選。 （4）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
為探索受m6A修飾調(diào)控的circRNA的作用機(jī)制，研究者從與PH過(guò)程有關(guān)的miRNA入手進(jìn)行了 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，從而確定了兩個(gè)與研究密切相關(guān)的circXpo6和circTmtc3。 （5）指標(biāo)驗(yàn)證
為確定circRNA在兩組間差異表達(dá)且發(fā)生差異m6A修飾，作者進(jìn)行了circRNA結(jié)構(gòu)及表達(dá)量鑒定，此外通過(guò)MeRIP-qPCR對(duì)其修飾水平也進(jìn)行了鑒定。這一結(jié)果說(shuō)明m6A修飾調(diào)控的circRNA的表達(dá)可能參與到HPH的發(fā)展過(guò)程中。

云序生物m6A修飾研究五大模塊
01 m6A RNA修飾測(cè)序
m6A RNA修飾測(cè)序（m6A-MeRIP-seq）
對(duì)m6A RNA甲基化，目前流行的檢測(cè)手段為m6A-Seq技術(shù)，適用于m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測(cè)序：

• m6A 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA測(cè)序（涵蓋LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA測(cè)序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA測(cè)序
• m6A  miRNA測(cè)序

02 檢測(cè)整體m6A RNA修飾水平
 LC-MS/MS檢測(cè)整體RNA修飾水平
精準(zhǔn)高效，可以實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)，9類(lèi)修飾水平檢測(cè)，一步到位。
比色法檢測(cè)整體RNA修飾水平
快速檢測(cè)m6A整體甲基化水平
03 m6A RNA修飾上游酶的篩選
m6A RNA修飾相關(guān)酶PCR芯片
尋找上游直接調(diào)控m6A RNA甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶。
04 m6A RNA修飾靶基因驗(yàn)證
 MeRIP-qPCR
云序提供各類(lèi)不同修飾的meRIP-qPCR服務(wù)，可針對(duì)mRNA，lncRNA，環(huán)狀RNA等不同類(lèi)型的RNA分子進(jìn)行檢測(cè)，低通量驗(yàn)證RNA修飾靶基因表達(dá)水平。
05機(jī)制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
篩選或驗(yàn)證RNA修飾直接靶點(diǎn)，研究RNA修飾靶基因的調(diào)控機(jī)制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)RNA互作基因或蛋白，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.3 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
驗(yàn)證兩基因互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制。
5.4 ChIP-seq
篩選或驗(yàn)證目標(biāo)蛋白與DNA互作，研究相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制