文章導(dǎo)讀
環(huán)狀RNA (circRNA)作為新型非編碼RNA,具有比線性RNA更加穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可通過多種機(jī)制調(diào)控靶基因。近年來，circRNA被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，作為腫瘤的診斷生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，具有巨大的價(jià)值，受到廣泛的關(guān)注。癌癥新的證據(jù)表明，circRNAs在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用。云序用戶山東大學(xué)劉志方課題組近期在Molecular Cancer雜志上發(fā)表的文章，通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、分子實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞動(dòng)物表型實(shí)驗(yàn)探討了hsa_circ_0004872在胃癌（GC）中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

 

發(fā)表雜志：Molecular Cancer
影響因子：15.302
發(fā)表時(shí)間：2020.11.10
技術(shù)方法：全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、RIP-qPCR、pull down、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、ChIP
文章鏈接：Circular RNA hsa_circ_0004872 inhibits gastric cancer progression via the miR-224/Smad4/ADAR1 successive regulatory circuit

1. 高通量測(cè)序篩選發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004872在GC中下調(diào)
作者通過對(duì)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行circRNA分析，篩選出4個(gè)在GC中差異表達(dá)的circRNA，通過在42對(duì)組織樣品中進(jìn)行qPCR驗(yàn)證篩選出差異最顯著的hsa_circ_0004872，并通過sanger測(cè)序驗(yàn)證了反式剪切位點(diǎn)處序列。作者還進(jìn)一步擴(kuò)大樣品量，在34對(duì)組織樣品中qPCR驗(yàn)證了hsa_circ_0004872的差異表達(dá)，并通過酶耐受實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該環(huán)狀的穩(wěn)定性。

2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過表達(dá)hsa_circ_0004872抑制GC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移
在GC細(xì)胞中通過構(gòu)建的質(zhì)粒過表達(dá)hsa_circ_0004872發(fā)現(xiàn)抑制了細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。而通過siRNA敲降hsa_circ_0004872則增加了細(xì)胞增侵襲和遷移。

3. hsa_circ_0004872作為分子海綿吸附miR-224
作者首先通過FISH實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到hsa_circ_0004872主要分布在細(xì)胞質(zhì)。然后通過RIP-qPCR驗(yàn)證到hsa_circ_0004872與AGO2蛋白結(jié)合，pull down實(shí)驗(yàn)顯示hsa_circ_0004872與miR-224結(jié)合。qPCR顯示敲降和過表達(dá)hsa_circ_0004872可以影響miR-224轉(zhuǎn)錄本水平，并且在GC組中miR-224也檢測(cè)到差異表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-224可以與hsa_circ_0004872結(jié)合。

4. miR-224通過靶向p21和Smad4促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移
驗(yàn)證了hsa_circ_0004872結(jié)合并調(diào)控miR-224后，作者接下來驗(yàn)證了miR-224對(duì)細(xì)胞的影響。EdU和CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-224促進(jìn)GC細(xì)胞增殖。劃痕傷口愈合實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-224促進(jìn)GC細(xì)胞侵襲和遷移。對(duì)miR-224下游靶基因的研究發(fā)現(xiàn)，miR-224可抑制p21 和Smad4基因的轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證到miR-224結(jié)合p21 和Smad4的3’-UTR區(qū)。最后，敲降hsa_circ_0004872后驗(yàn)證到了p21 和Smad4的表達(dá)受到抑制。

5. 回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明hsa_circ_0004872通過 miR-224產(chǎn)生抑癌作用
作者在過表達(dá)hsa_circ_0004872的細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-224，發(fā)現(xiàn)可終止hsa_circ_0004872對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，同時(shí)也會(huì)使原本升高的Smad4和p21表達(dá)降低。

 

6. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hsa_circ_0004872抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移
通過皮下注射過表達(dá)hsa_circ_0004872的BGC-823細(xì)胞和對(duì)照組BGC-823細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)hsa_circ_0004872組生成的腫瘤明顯小于對(duì)照組，并且腫瘤中Smad4和p21表達(dá)升高。尾靜脈注射實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hsa_circ_0004872組肺表面形成的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)明顯要小于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，hsa_circ_0004872能夠抑制腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

 
7. hsa_circ_0004872受RNA編輯蛋白ADAR1調(diào)控
為了尋找調(diào)控hsa_circ_0004872的因素，作者通過對(duì)數(shù)據(jù)庫中GC樣品中基因表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白ADAR1在GC組中經(jīng)常顯著上升，并通過qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證。同時(shí)數(shù)據(jù)分析也顯示GC 組織中ADAR1蛋白的高表達(dá)與短生存周期相關(guān)。于是，作者在GC細(xì)胞中敲降和過表達(dá)ADAR1，發(fā)現(xiàn)敲降A(chǔ)DAR1后hsa_circ_0004872表達(dá)上升，miR-224表達(dá)水平降低；而過表達(dá)ADAR1，hsa_circ_0004872表達(dá)降低并且miR-224水平上升。這些結(jié)果表明ADAR1可以通過hsa_circ_0004872調(diào)控miR-224。

8. Smad4通過ADAR1調(diào)控hsa_circ_0004872
最后，有趣的是，hsa_circ_0004872通過miR-224調(diào)控的靶基因Smad4是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，作者通過ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證到了Smad4可以結(jié)合ADAR1的啟動(dòng)子區(qū)，并且在GC細(xì)胞過表達(dá)Smad4會(huì)降低ADAR1的mRNA和蛋白水平。對(duì)數(shù)據(jù)庫中GC組織樣品的生信分析顯示ADAR1的表達(dá)與Smad4的表達(dá)負(fù)相關(guān)，并且Smad4的低表達(dá)與短生存周期相關(guān)。

 

 

總結(jié)
本研究通過全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出在GC組織中下調(diào)的hsa_circ_0004872，通過RIP-qPCR、pull down、和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其通過海綿機(jī)制吸附miR-224從而調(diào)控下游靶基因p21 和Smad4，產(chǎn)生抑癌作用。并且通過ChIP實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄因子Smad4又通過調(diào)控RNA結(jié)合蛋白ADAR1調(diào)控hsa_circ_0004872形成一個(gè)反饋回路。

云序生物環(huán)狀RNA研究?jī)?yōu)勢(shì)
云序生物作為國(guó)內(nèi)早期提供環(huán)狀RNA測(cè)序的測(cè)序公司，自行建立的環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫circDB，憑借物種覆蓋廣、數(shù)據(jù)量大、疾病背景多的特點(diǎn)為客戶提供優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。云序積累了超過10000例環(huán)狀RNA測(cè)序的經(jīng)驗(yàn)，樣本覆蓋20多個(gè)物種以及50多種疾病。云序生物提供系統(tǒng)性環(huán)狀RNA服務(wù)，從篩選（circRNA測(cè)序）到驗(yàn)證（qPCR）再到機(jī)制研究（RIP、RNA pull-down、ChIP）以及上游表觀調(diào)控（m6A甲基化等各類RNA修飾研究），全方位的覆蓋環(huán)狀RNA上下游分子機(jī)制驗(yàn)證的重要研究環(huán)節(jié)。除了提供組織和細(xì)胞的樣本類型測(cè)序之外，我們還提供體液、血清血漿、外泌體石蠟樣本等特殊樣本的測(cè)序服務(wù)。
 
云序環(huán)狀RNA課題技術(shù)服務(wù)四大模塊
一、 環(huán)狀RNA篩選：
1.1 circRNA測(cè)序
1.2 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
同時(shí)檢測(cè)circRNA、lncRNA、mRNA
二、環(huán)狀RNA驗(yàn)證
2.1 qRT-PCR
對(duì)選定目標(biāo)RNA分子可進(jìn)行qPCR檢測(cè)服務(wù)，包括引物設(shè)計(jì)與表達(dá)鑒定。
2.2 Sanger測(cè)序與RNase R酶耐受實(shí)驗(yàn)
對(duì)選定的環(huán)狀RNA分子進(jìn)行反式剪切位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增后Sanger測(cè)序驗(yàn)證環(huán)狀；使用RNase R酶處理環(huán)狀RNA分子，驗(yàn)證環(huán)狀RNA分子穩(wěn)定性。
三、 CircRNA功能機(jī)制研究
3.1 RIP測(cè)序/RIP-qPCR
針對(duì)目標(biāo)蛋白抗體把蛋白-RNA復(fù)合物沉淀下來，并對(duì)復(fù)合物上的RNA進(jìn)行測(cè)序或?qū)δ繕?biāo)RNA進(jìn)行qRCR表達(dá)分析。
3.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
設(shè)計(jì)目標(biāo)RNA生物探針把相應(yīng)的結(jié)合蛋白質(zhì)與RNA復(fù)合物沉淀下來，蛋白質(zhì)譜檢測(cè)或WB檢測(cè)與RNA結(jié)合的蛋白。設(shè)計(jì)目標(biāo)RNA生物探針把相應(yīng)的結(jié)合蛋白質(zhì)與RNA復(fù)合物沉淀下來，qPCR檢測(cè)或RNA-seq檢測(cè)與RNA結(jié)合的RNA。
3.3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩個(gè)基因之間的互作。
3.4 ChIP測(cè)序/ChIP-PCR
檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子或者組蛋白與下游基因的結(jié)合情況。
四、CircRNA修飾研究
4.1 m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修飾
針對(duì)環(huán)狀RNA各類修飾進(jìn)行高通量篩選。
4.2 MeRIP-circRNA-PCR驗(yàn)證
對(duì)高通量測(cè)序的結(jié)果，通過qPCR進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。
 
 

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