文章導讀
如今想要短平快靠單純測序+驗證發(fā)表一篇5分左右文章，光靠一個熱點環(huán)狀RNA還不夠，環(huán)狀RNA+外泌體，環(huán)狀RNA+m6A，環(huán)狀RNA+環(huán)狀DNA等方向都是可以去嘗試的。小編今 天以云序用戶以環(huán)狀RNA+外泌體作為研究方向的案例進行解析。
2020年6月18日云序用戶山大二院在Frontiers in Oncology (IF=4.85)上發(fā)表了一篇題目RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer的文章，該文章通過運用了云序生物外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序探究了環(huán)狀RNA作為結(jié)腸ai分子標志物的可能性。
結(jié)腸ai（CRC）是第三大常見惡性腫 瘤，早期CRC患者存活率大 大高于晚期患者，腫 瘤的早期診斷對改善預后至關(guān)重要。近年來有許多研究發(fā)現(xiàn)，外泌體作為廣 泛存在于體液中的一種微囊泡，含有大量DNA、RNA和蛋白等分子，可以反應(yīng)他們來源細胞的信息。許多ai細胞來源的外泌體內(nèi)的分子具有成為ai癥分子標志物的潛力。這其中，環(huán)狀RNA由于其穩(wěn)定性高，被作為多種ai癥的分子標志物研究過。在這篇文章中，作者通過對50個患者和50和健康人血清中外泌體環(huán)狀RNA的研究，提出了其中circ-PNN作為CRC診斷分子標志物的可能。

發(fā)表期刊：Frontiers in Oncology
影響因子：4.85
發(fā)表時間：2020.6.18
實驗方法: 外泌體提取、鑒定、全轉(zhuǎn)錄組測序、circRNA-PCR、circRNA酶耐受、sanger測序（均由云序一站式提供）
文章鏈接：RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer

研究內(nèi)容
1.環(huán)狀RNA表達譜
作者將50個CRC患者和50個正常人的血清樣品分別隨機分為5組均勻混樣，對混樣后的5v5個樣品進行了外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序, 檢測到1924個環(huán)狀RNA, 來源基因在各染色體上均有分布，環(huán)狀大部分長度小于500nt。 2.CRC患者和健康人中環(huán)狀RNA的差異表達
接著作者篩選出了122個在CRC與健康人血清外泌體中差異表達的環(huán)狀RNA，其中100個明顯上調(diào)，22個明顯下調(diào)。其中65個為新發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA。 3.差異環(huán)狀RNA的功能預測
通過對環(huán)狀RNA來源基因的GO分析預測差異環(huán)狀RNA的功能，結(jié)果顯示上調(diào)的環(huán)狀的潛在功能富集在蛋白修飾和細胞對內(nèi)源性刺激的反應(yīng)相關(guān)功能，高爾基體相關(guān)功能和轉(zhuǎn)錄共激 活子活性相關(guān)功能。此外KEGG分析還找到了這些基因參與的4個相關(guān)通路。 4.血清外泌體的鑒定
對從血清中提取的外泌體，通過電鏡鑒定驗證了外泌體形態(tài)，NTA分析檢測了外泌體粒徑大小，WB驗證了外泌體標志蛋白CD9和TSG101。 5.Circ-PNN的生物學結(jié)構(gòu)
作者通過qPCR驗證了circ-PNN的差異表達，并對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序驗證了環(huán)狀反式剪切位點的序列，并驗證了發(fā)散引物僅能對環(huán)狀RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA成功擴增，而對基因組DNA擴增無效。酶耐受實驗證實了circ-PNN比對應(yīng)的PNN線性mRNA更穩(wěn)定。 6.標志物circRNA分子的驗證
作者擴大樣本在88個CRC患者和88個健康人的血清外泌體RNA中，通過qPCR驗證了circ-PNN的差異表達。通過ROC曲線分析對circ-PNN作為診斷標志物的潛力進行了研究。結(jié)果顯示circ-PNN的差異表達與CRC相關(guān)，可能作為早期CRC但不是淋巴轉(zhuǎn)移期的診斷標志物。 7.CircRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)預測和分析

作者建立了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，預測circ-PNN可能作用的靶基因，并通過qPCR驗證了其中3個miRNA與circ-PNN的相關(guān)性。對靶基因的預測為未來研究circ-PNN影響CRC腫 瘤形成提供了方向。

總結(jié)
本文作者通過外泌體全轉(zhuǎn)錄組測序、qPCR和Sanger測序的手段，展示了CRC中circRNA的表達譜，篩選了差異表達的circRNA，驗證了其中circ-PNN的差異表達和序列，并在大量樣本中驗證了circ-PNN的差異表達，通過ROC分析了其作為早期CRC診斷分子標志物的可能。通過circ-PNN與miRNA共表達分析也為后續(xù)研究外泌體circ-PNN在CRC發(fā)病過程中的作用提供了線索。

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