lncRNA分子通過(guò)海綿機(jī)制結(jié)合microRNA發(fā)揮生物學(xué)功能，這個(gè)ceRNA機(jī)制已經(jīng)讓大家心生厭倦了。可大牛就是大牛，引入甲基化就能輕松的變廢為寶，竟然能讓lncRNA的ceRNA思路變得瞬間高大上發(fā)表10分以上的文章，你一定和小編我一樣很好奇他是怎么做到的。
RNA甲基化，作為最新的國(guó)自然熱點(diǎn)受到了越來(lái)越多的關(guān)注，更多的研究開(kāi)始著重RNA甲基化方向的討論與研究，僅僅在剛剛過(guò)去的兩個(gè)月當(dāng)中，10+的RNA甲基化文章就多達(dá)16篇。2018年國(guó)自然立項(xiàng)情況來(lái)看RNA甲基化中標(biāo)數(shù)目是2017年的4倍之多，其中不少項(xiàng)目開(kāi)始從mRNA轉(zhuǎn)為關(guān)注非編碼RNA的甲基化對(duì)于疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程重要作用的研究，例如m6A甲基化lncRNAs在套細(xì)胞淋巴瘤中的作用與機(jī)制研究（北京大學(xué)），RNA去甲基化酶FTO介導(dǎo)的lncRNA-m6A修飾對(duì)肝癌細(xì)胞重編程的調(diào)控作用及機(jī)制研究（同濟(jì)大學(xué)）等等。云序生物以同濟(jì)大學(xué)康九紅團(tuán)隊(duì)于2018年2月發(fā)表在Nucleic Acid Research（影響因子11.561）為例給大家講講，lncRNA分子發(fā)生甲基化該如何研究。

1. linc1281對(duì)于mESC（小鼠胚胎干細(xì)胞）分化必不可少
研究表明主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中的linc1281對(duì)于mESCs細(xì)胞的分化是不可或缺的，shRNA方法沉默內(nèi)源表達(dá)的linc1281使細(xì)胞展現(xiàn)正常的自我更新特征，但mESCs特征性的基因Oct4、Sox2和Nanog表達(dá)沒(méi)有改變，暗示linc1281可能和其他生物學(xué)功能相關(guān)。研究者將lincRNA沉默的細(xì)胞注射至免疫缺陷的小鼠當(dāng)中，相比于對(duì)照組，linc1281沉默的小鼠畸胎瘤生長(zhǎng)在體積和重量方面明顯小于對(duì)照組腫瘤。HE染色以及免疫組織化學(xué)結(jié)果表明linc1281分子的沉默可以有效的阻滯mESCs的分化過(guò)程。此外在體外研究mESCs細(xì)胞分為中胚層源心肌細(xì)胞和外胚層源神經(jīng)細(xì)胞系的能力時(shí)發(fā)現(xiàn)linc1281對(duì)多能性相關(guān)marker表達(dá)無(wú)顯著影響，而使mESCs分化能力顯著減弱。另一方面對(duì)linc1281的過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)mESCs的分化能力。

2. 深入研究的linc1281發(fā)生m6A甲基化修飾
最近的研究表明m6A RNA甲基化修飾能夠影響mESCs的細(xì)胞命運(yùn)，很多mESCs特異的轉(zhuǎn)錄本都會(huì)受到m6A修飾，那么自然而然產(chǎn)生疑問(wèn)，前期已經(jīng)深入研究的linc1281會(huì)不會(huì)有m6A甲基化修飾？對(duì)mESCs如此重要的lincRNA分子是否也受到m6A甲基化調(diào)控？MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)linc1281確實(shí)發(fā)生甲基化修飾，并且shRNA沉默下調(diào)RNA甲基化酶Mettl3使得linc1281的甲基化水平下降，證明Mettl3是調(diào)控linc1281的RNA甲基化酶
 

3. linc1281甲基化水平和該分子的生物學(xué)功能呈正相關(guān)
Linc1281長(zhǎng)1306nt，整個(gè)序列當(dāng)中有3個(gè)m6A motif RRACU，通過(guò)構(gòu)建motif點(diǎn)突變、缺失突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293FT細(xì)胞當(dāng)中對(duì)外源性的linc1281進(jìn)行過(guò)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明linc1281 motif的突變使得linc1281甲基化水平顯著降低。在linc1281缺失的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)野生型linc1281、突變?nèi)笔�m6A的linc1281、m6A修飾的NC突變體等，RT-PCR表明突變?nèi)笔�m6A的細(xì)胞株在心肌細(xì)胞趨勢(shì)方面并不顯著，相反有m6A修飾的linc1281過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株分化程度最為顯著，并且sh1281+linc1281的質(zhì)粒能夠明顯促進(jìn)神經(jīng)分化，由此可以看到linc1281甲基化水平和mESCs的分化程度呈正相關(guān)。細(xì)胞回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明只有在m6A motif 完整的linc1281過(guò)表達(dá)條件下能夠恢復(fù)linc1281敲除細(xì)胞系的干細(xì)胞分化能力。得出結(jié)論linc1281的m6A修飾水平和干細(xì)胞分化能力直接相關(guān)。

4. linc1281甲基化能夠影響該分子的ceRNA模型
既然linc1281的m6A甲基化沒(méi)有影響到linc1281的表達(dá)量，那么m6A甲基化如何影響到該分子的生物學(xué)功能呢？通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)let-7家族和linc1281相互結(jié)合且均在胞漿當(dāng)中豐度較高，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)通過(guò)將linc1281全長(zhǎng)和micorRNA mimics共轉(zhuǎn)發(fā)現(xiàn)，僅有microRNA mimcs可以降低linc1281的熒光強(qiáng)度，相反如果對(duì)linc1281與microRNA結(jié)合區(qū)域進(jìn)行突變使兩者不發(fā)生結(jié)合，此時(shí)microRNA mimics并不能顯著降低linc1281的熒光強(qiáng)度，結(jié)合let-7表達(dá)量和linc1281呈負(fù)相關(guān)，證明let-7家族和lin1281確實(shí)發(fā)生直接結(jié)合。結(jié)合之前構(gòu)建的質(zhì)粒sh1281+linc1281、sh1281點(diǎn)突變等發(fā)現(xiàn)，對(duì)m6A motif的點(diǎn)突變處理后，let-7表達(dá)量無(wú)顯著變化，相反linc1281質(zhì)粒當(dāng)中l(wèi)et-7表達(dá)顯著下調(diào)，也就意味著m6A修飾影響到linc1281和let-7家族microRNA的結(jié)合，即m6A甲基化修飾影響到了該非編碼RNA分子的ceRNA模型。作者進(jìn)一步通過(guò)對(duì)METTL3的沉默、突變處理和相關(guān)細(xì)胞回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，linc1281的m6A修飾確實(shí)能夠影響到linc1281和microRNA的相互結(jié)合。這一點(diǎn)合理的解釋了m6A在不影響到表達(dá)水平的情況下如何影響生物學(xué)功能的問(wèn)題。

總結(jié)：
    在RNA甲基化研究領(lǐng)域當(dāng)中，對(duì)于mRNA的甲基化研究目前最多，而對(duì)于非編碼部分（lncRNA、circRNA、pri-miRNA等）的甲基化研究相對(duì)較少，相對(duì)而言非編碼的RNA的甲基化研究可以說(shuō)更為時(shí)髦。云序生物公眾號(hào)之前已經(jīng)對(duì)非編碼RNA發(fā)生RNA甲基化研究文章進(jìn)行匯總整理（插入之前的公眾號(hào)鏈接），我們將RNA甲基化的適用人群做了兩類劃分：1科研人員過(guò)去已經(jīng)對(duì)某些mRNA，lncRNA，circRNA有一定的研究基礎(chǔ)，可以考慮引入RNA甲基化，檢測(cè)是否有發(fā)生RNA甲基化修飾并且該修飾是否能直接和細(xì)胞表型相關(guān)聯(lián)，發(fā)表一篇高質(zhì)量的RNA甲基化文章。2沒(méi)有前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的科研人員也可以同時(shí)展開(kāi)對(duì)RNA甲基化的檢測(cè)以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（mRNA測(cè)序，lncRNA測(cè)序，環(huán)狀RNA測(cè)序），迅速選定發(fā)生RNA甲基化并且轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)生改變的基因，尋求兩組學(xué)之間的關(guān)系，還可以增加RNA甲基化上游一些相關(guān)酶的研究（甲基化酶，去甲基化酶等）。
重點(diǎn)：云序生物全面的RNA甲基化測(cè)序服務(wù)是您的優(yōu)質(zhì)選擇，非編碼RNA和編碼RNA分子的甲基化測(cè)序、3種RNA甲基化修飾（m6A，m5C，m1A），應(yīng)有盡有，想發(fā)高分文章嗎？還在等什么？

RNA甲基化高分文章羅列

 

云序生物RNA甲基化產(chǎn)品列表

 
云序相關(guān)產(chǎn)品推薦：
 m6A RNA甲基化測(cè)序
m5C RNA甲基化測(cè)序
m1A RNA甲基化測(cè)序
RNA Pull Down
RIP
 
往期回顧：
云序生物最新m6A“RNA甲基化”研究匯總—非編碼RNA甲基化篇
花式虐狗：circRNA和m6A相愛(ài)了
Plant Cell：擬南芥發(fā)現(xiàn)全新m6A RNA 去甲基化修飾酶
Cancer cell：何川教授再發(fā)現(xiàn)m6A RNA甲基化重要功能
Nature重磅：m6A RNA甲基化參與造血干細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵環(huán)節(jié)！
 
 
上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址：上海市松江區(qū)漕河涇開(kāi)發(fā)區(qū)莘磚公路518號(hào)20號(hào)樓3樓電話：021-64878766
傳真：021-64878766
網(wǎng)址：www.cloud-seq.com.cn
郵箱：market@cloud-seq.com.cn