銳博生物：環(huán)狀RNA—隱秘的未知RNA平行宇宙

環(huán)狀RNA，被喻是隱秘的未知RNA平行宇宙。最近，復(fù)旦大學(xué)的鄭秋鵬博士（2016交流會(huì)嘉賓之一）以第一作者身份在Nature Communications上發(fā)布了他們關(guān)于circHIPK3的最新研究成果�，F(xiàn)在就和小編一起來(lái)學(xué)習(xí)circRNA的研究思路，認(rèn)識(shí)圓圈重塑的RNA世界吧。

環(huán)狀RNA測(cè)序的樣本選擇、分析方法

RNA測(cè)序分析來(lái)自6個(gè)正常組織（腦、結(jié)腸、心臟、肝、肺、胃）和7個(gè)癌癥組織（膀胱尿路上皮癌、乳癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌）的去核糖體RNA后的總RNA，發(fā)現(xiàn)了67,358個(gè)潛在的環(huán)狀RNA，其中27,296含有至少兩個(gè)unique back-spliced reads。

研究者使用RefSeq database 24對(duì)這些環(huán)狀RNA進(jìn)行注釋；環(huán)狀RNA表達(dá)差異使用Wilcoxon rank-sum test計(jì)算，比較癌癥樣本與相應(yīng)正常組織樣本。

初步鑒定預(yù)測(cè)的新環(huán)狀RNA

為排除它們是線性的反式剪接產(chǎn)物，研究者檢測(cè)了它們的物理特性。針對(duì)36個(gè)共同表達(dá)的待鑒定環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄本，設(shè)計(jì)了Outward-facing引物。每對(duì)引物分別擴(kuò)增一個(gè)來(lái)自HEK-293T cDNA的不同產(chǎn)物。在RNase R處理后，全部36個(gè)back-spliced序列都明顯存在。

選擇哪個(gè)環(huán)狀RNA繼續(xù)下游功能研究呢？

通過(guò)錨點(diǎn)比對(duì) (Anchor alignment)，根據(jù)它們的線性形式，給測(cè)序數(shù)據(jù)中每一個(gè)環(huán)狀RNA進(jìn)行豐度定量。研究者檢測(cè)了它們的5’端和3’端成環(huán)比 (circular ratio，CR)，以5’ CR>0.2; 3’ CR>0.2; SRPBM>1為標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，得到了990個(gè)高豐度表達(dá)的環(huán)狀RNA。研究者留意到，這里面的其中一個(gè)環(huán)狀RNA來(lái)自于HIPK3基因Exon2，命名為circHIPK3，豐度與back-spliced（反向剪接）比都很高。

多維尺度法篩選高豐度circRNA。紅點(diǎn)和黑點(diǎn)分別表示高豐度和低豐度circRNA，circHIPK3以藍(lán)點(diǎn)顯示。灰色部分為篩選得的高豐度circRNA。

 

環(huán)狀RNA研究第一步：鑒定環(huán)狀

研究者使用outward-facing引物擴(kuò)增出了預(yù)期大小的不同產(chǎn)物，并通過(guò)sanger測(cè)序確定了序列。環(huán)狀的表達(dá)水平通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果與RNA-seq一致，在多種組織里的表達(dá)量均高于其線性形式。

然后研究者檢測(cè)了它在HeLa細(xì)胞中的穩(wěn)定性和定位情況，用Actinomycin D（轉(zhuǎn)錄抑制劑）處理細(xì)胞后，環(huán)狀RNA仍具有高穩(wěn)定性，并能抵抗RNase R外切酶消化，表明它確實(shí)為環(huán)狀形式。

e) qRT-PCR顯示了circHIPK3和HIPK3 mRNA在HeLa細(xì)胞質(zhì)或核。f) circHIPK3的RNA FISH實(shí)驗(yàn)。

circHIPK3是如何形成的？

HIPK3 Exon2兩側(cè)的外顯子分析顯示，高度互補(bǔ)Alu重復(fù)序列與28個(gè)短散在重復(fù)序列 (SINE) 處在HIPK3 Exon2上游的內(nèi)含子中，51個(gè)SINE處于Exon3下游。研究者使用CRISPR/Cas9技術(shù)，去除了HEK-293T細(xì)胞中的circHIPK3側(cè)翼Alu序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下游Alu序列刪除后，環(huán)化被抑制，但上游Alu刪除后不僅沒(méi)有減少circHIPK3的生成，還稍微增加了。

 

示意圖顯示基因組上HIPK Exon2區(qū)域含有側(cè)翼Alu重復(fù)序列和長(zhǎng)內(nèi)含子。Alu元件和長(zhǎng)內(nèi)含子使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行刪除(gRNA1-6)。在gRNA兩側(cè)的引物用于檢測(cè)刪除效果(P1-5)

引物環(huán)狀外顯子的上游有許多Alu元件，研究者猜測(cè)內(nèi)含子中有其他Alu元件可能促進(jìn)環(huán)化，于是刪除了上游大的內(nèi)含子 (gRNA5、gRNA6)，結(jié)果circHIPK3顯著下調(diào)，而HIPK3 mRNA沒(méi)有變化，證明刪除只影響back spilcing，而不影響典型的剪接，表明帶Alu互補(bǔ)重復(fù)序列的側(cè)翼長(zhǎng)內(nèi)含子，是circHIPK3生成所必需的。

使用4對(duì)gRNA把序列刪除(gRNA3-6)，進(jìn)行普通PCR和qRT-PCR，引物位點(diǎn)設(shè)計(jì)在刪除區(qū)域外(P4+P5)

 

銳博小編說(shuō)

RNA是怎樣變成環(huán)狀的呢？

a. 在可變剪切過(guò)程中，外顯子遷移，剪切形成套索結(jié)構(gòu)，拉近剪切位點(diǎn)，促進(jìn)序列成環(huán)

b. 依賴鄰近的反向互補(bǔ)序列配對(duì)，拉近剪切位點(diǎn)，使其相互攻擊，促進(jìn)序列成環(huán)

c. 單個(gè)內(nèi)含子直接成環(huán)

d. RNA結(jié)合蛋白、反式作用因子參與成環(huán)

研究功能，敲降看看

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，環(huán)狀RNA可以被小干擾RNA敲降7。如下圖所示，研究者使用了三種siRNA：一種靶向backsplice序列 (si-circHIPK3)，一種靶向線性轉(zhuǎn)錄本 (si-HIPK3)，一種靶向線性和環(huán)狀共有的環(huán)狀外顯子 (si-both)，均由銳博生物提供。接著，研究者通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及EdU染色（銳博生物提供）觀察敲降后的情況，發(fā)現(xiàn)si-circHIPK3能抑制幾種不同的細(xì)胞生長(zhǎng)，而si-HIPK3不能。

通過(guò)EdU試驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染3種siRNA 48h后Huh-7細(xì)胞的DNA合成情況。

circHIPK3充當(dāng)miRNA海綿

來(lái)自doRiNA的AGO2 CLIP-Seq公開數(shù)據(jù)顯示AGO2位于circHIPK3區(qū)域。研究者進(jìn)行了pull down、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證明了circHIPK3可能是AGO2和miRNA結(jié)合的中間媒體。

為了尋找與circHIPK3結(jié)合的miRNA，研究者使用熒光素酶篩選miRNA文庫(kù)。在424個(gè)miRNA中，有9條miRNA能夠顯著減弱熒光素酶報(bào)告基因活性。使用TargetScan和PicTarmiRNA預(yù)測(cè)軟件，發(fā)現(xiàn)它們含有circHIPK3區(qū)結(jié)合位點(diǎn)。于是研究者把這些結(jié)合位點(diǎn)突變了，轉(zhuǎn)染突變后的miRNA，并不能減少報(bào)告基因活性。此項(xiàng)結(jié)果表明circHIPK3可能是這些miRNA的海綿 (sponge)。

 

HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染424個(gè)miRNA mimic，進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)篩選，鑒定它們是否能夠與circHIPK3結(jié)合。圖中標(biāo)注的9個(gè)miRNA對(duì)酶活抑制較明顯。

 

值得注意的是，這9種miRNA都能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，其中miR-124效果最顯著，于是研究者使用生物素偶聯(lián)的miR-124 mimic（銳博生物提供），富集了大量circHIPK3。多個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果綜合表明，circHIPK3能夠直接結(jié)合到miR-124，抑制其活性。

左圖：HEK-293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染3‘偶聯(lián)鏈霉親和素的miR-124后，捕獲得的細(xì)胞裂解液中circHIPK3水平；右圖：轉(zhuǎn)染si-cHIPK3、miR-124或cHIPK3載體到HEK-293T細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)IL6R和DLX2表達(dá)情況。IL6R和DLX2是miR-124的兩個(gè)已知的增殖促進(jìn)靶標(biāo)，會(huì)隨著circHIPK3的敲降而下調(diào)，表明circHIPK3可以挽救miR-124對(duì)它們的抑制。

銳博小編說(shuō)

環(huán)狀RNA有什么功能和作用？

1. 調(diào)控親本基因表達(dá)

僅有內(nèi)含子的ciRNA與pol II結(jié)合促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄

有內(nèi)含子+外顯子的ElciRNA與U1 snRNP形成復(fù)合體，再與pol II結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄

2. 充當(dāng)ceRNA

僅有外顯子的circRNA有MRE，吸附miRNA，調(diào)控miRNA表達(dá)（miRNA海綿）

3. 作為疾病的biomarker

上海研究者：Exosomes里也有環(huán)狀RNA

4. 成為新的疾病治療靶點(diǎn)

原文：Zheng Q, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6;7:11215.   

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