調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的CD4+ T細(xì)胞亞群，也是腫瘤微環(huán)境中免疫抑制屏障的主要構(gòu)成細(xì)胞。因此，特異性地調(diào)控腫瘤微環(huán)境的Treg細(xì)胞使其功能與穩(wěn)定性發(fā)生改變，將能夠促進(jìn)腫瘤殺傷反應(yīng)的發(fā)生。

2024年，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所李斌課題組及合作團(tuán)隊(duì)在國際期刊Nature Communications在線發(fā)表了題為“FOXP3+ regulatory T cell perturbation mediated by the IFNγ-STAT1-IFITM3 feedback loop is essential for anti-tumor immunity”的研究論文。該研究首次提出了腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞中IFN-γ依賴的STAT1-IFITM3負(fù)反饋環(huán)路。此環(huán)路通過平衡STAT1與IFITM3的表達(dá)量進(jìn)而維持腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，當(dāng)該環(huán)路出現(xiàn)不平衡，則會(huì)引起Treg免疫抑制功能下降，促炎功能上升的功能擾動(dòng)變化。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://www.nature.com/articles/s41467-023-44391-9）

研究材料
在本研究中，研究人員構(gòu)建了Treg條件性敲除Ifitm3和Treg特異性敲除Stat1的小鼠，以及兩者雙敲的小鼠。Ifitm3f/fFoxp3YFP-Cre小鼠（cKO），Stat1f/fFoxp3YFP-Cre小鼠（SKO)，Stat1f/fIfitm3f/fFoxp3YFP-Cre（DKO）（其中Ifitm3f/f小鼠與Stat1f/f小鼠由賽業(yè)生物提供）進(jìn)行體內(nèi)研究。

研究方法
本研究采用體內(nèi)體外研究相結(jié)合，通過臨床腫瘤患者樣本分析，小鼠腫瘤模型構(gòu)建，腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞流式分析，結(jié)合RNA-seq，ChIP，免疫共沉淀等生化實(shí)驗(yàn)，評(píng)估IFNγ-STAT1-IFITM3負(fù)反饋環(huán)路對(duì)Treg細(xì)胞功能與穩(wěn)定性所產(chǎn)生的調(diào)控作用。

技術(shù)路線
01 IFITM3缺失的Treg細(xì)胞會(huì)促進(jìn)腫瘤殺傷反應(yīng)
02 IFITM3結(jié)合JAK-STAT1復(fù)合體并抑制STAT1的磷酸化激活
03 IFITM3與STAT1形成相互調(diào)節(jié)的負(fù)反饋環(huán)路
04 IFNγ-STAT1-IFITM3負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能

研究結(jié)果
1. IFITM3在Treg細(xì)胞中的缺失會(huì)增強(qiáng)腫瘤殺傷反應(yīng)
研究人員在WT與cKO小鼠中構(gòu)建了皮下MC38移植瘤型。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，cKO小鼠的皮下腫瘤體積明顯變�。▓D1 a），腫瘤重量也明顯小于WT小鼠（圖1 b），荷瘤小鼠的生存曲線也出現(xiàn)了同樣的變化趨勢(shì)（圖1 c）。

cKO小鼠的腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)著更高比例的CD8+ T細(xì)胞與NK細(xì)胞（圖1 d,e）。此外，cKO小鼠腫瘤中浸潤(rùn)的Teff細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞顯示出增殖更強(qiáng)的現(xiàn)象（圖1 f）。通過流式檢測(cè)Teff細(xì)胞與CD8+ T細(xì)胞分泌的抗腫瘤細(xì)胞因子IFN-γ與TNF-α，研究人員發(fā)現(xiàn)，cKO小鼠腫瘤中浸潤(rùn)的殺傷性細(xì)胞確實(shí)分泌了更多的抗腫瘤細(xì)胞因子（圖1 g,h）。這說明cKO小鼠腫瘤生長(zhǎng)受到抑制的直接原因是cKO小鼠的腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)了更多比例且殺傷能力更強(qiáng)的腫瘤殺傷性細(xì)胞。
 

圖1 缺失IFITM3的Treg細(xì)胞促進(jìn)腫瘤殺傷反應(yīng)[1]

2. IFITM3結(jié)合JAK-STAT1復(fù)合體并抑制STAT1的磷酸化激活
IFITM3缺失的Treg細(xì)胞中，STAT1的蛋白水平顯著上升（圖2 a）。敲除IFTM3后，Treg細(xì)胞內(nèi)STAT1的磷酸化（Tyr701）水平顯著上升（圖2 b,c）。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示，IFITM3缺失的Treg細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT1水平上升，入核增加，且STAT1的蛋白量上升。提示IFITM3可能通過影響STAT1的磷酸化對(duì)STAT1的入核產(chǎn)生影響（圖2 d）。對(duì)WT與Ifitm3敲除的Treg細(xì)胞的ChIP-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Ifitm3敲除后，STAT1對(duì)其下游基因Ifi44與Psmb9的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)確實(shí)增強(qiáng)（圖2 e）。
 

圖2 IFITM3結(jié)合JAK-STAT1復(fù)合體并抑制STAT1的磷酸化激活[1]

3. IFITM3與STAT1形成相互調(diào)節(jié)的負(fù)反饋環(huán)路
STAT1與IFITM3都是能夠被IFN-γ細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。STAT1能夠在細(xì)胞膜接受信號(hào)，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核介導(dǎo)其下游基因的轉(zhuǎn)錄。因此研究人員產(chǎn)生了一個(gè)猜測(cè)，STAT1是否也能夠調(diào)節(jié)IFITM3的表達(dá)呢？首先，研究人員發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)Th1反應(yīng)的細(xì)胞因子，IFN-γ，IL-12與IL-27均能夠誘導(dǎo)IFITM3與STAT1的表達(dá)（圖3 a）。接下來，研究人員構(gòu)建了STAT1條件性敲除的小鼠（其中Stat1f/f小鼠小鼠由賽業(yè)生物提供）。檢測(cè)結(jié)果顯示，STAT1缺失后，Treg細(xì)胞內(nèi)的IFITM3蛋白表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（圖3 b,c）。這說明STAT1能夠調(diào)節(jié)IFITM3的轉(zhuǎn)錄翻譯，且接下來，研究人員預(yù)測(cè)了STAT1在Ifitm3轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域上的結(jié)合位點(diǎn)，并通過ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到STAT1能夠結(jié)合在Ifitm3的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)而影響Ifitm3的轉(zhuǎn)錄翻譯過程（圖3 d）。
 

圖3 IFITM3與STAT1形成相互調(diào)節(jié)的負(fù)反饋環(huán)路[1]

4. IFNγ-STAT1-IFITM3負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能
接下來，研究人員對(duì)WT小鼠，cKO小鼠，SKO小鼠與DKO小鼠（其中Ifitm3f/f小鼠與Stat1f/f小鼠由賽業(yè)生物提供）建立了MC38皮下移植瘤模型，在體內(nèi)的腫瘤模型中評(píng)估STAT1-IFITM3負(fù)反饋環(huán)路的功能。結(jié)果顯示，cKO小鼠與SKO小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤重量受到顯著抑制，而DKO小鼠的腫瘤生長(zhǎng)趨勢(shì)則與WT小鼠十分接近（圖4 a,b）。腫瘤浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞比例以及Treg細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞，NK細(xì)胞的數(shù)目檢測(cè)結(jié)果也顯示，cKO小鼠與SKO小鼠的腫瘤中浸潤(rùn)著更高比例的Treg細(xì)胞和腫瘤殺傷性細(xì)胞，可是DKO小鼠卻沒有發(fā)生此變化（圖4 c-f）。與此一致的是，cKO小鼠與SKO小鼠腫瘤浸潤(rùn)的CD4+與CD8+殺傷性T細(xì)胞均分泌更高水平的IFN-γ，因此引起了更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，可是DKO小鼠腫瘤浸潤(rùn)的殺傷性T細(xì)胞分泌的IFN-γ水平與WT幾乎沒有差異，甚至可能更低（圖4 g,h）。
 

圖4 IFNγ-STAT1-IFITM3負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能[1]

研究結(jié)論

圖5 STAT1-IFITM3反饋環(huán)路[1]

綜上，研究團(tuán)隊(duì)提出，STAT1-IFITM3反饋環(huán)路可能是Treg特異性抗腫瘤療法的潛在靶點(diǎn)。阻斷STAT1或IFITM3的表達(dá)能夠破壞該環(huán)路的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致Treg出現(xiàn)功能不穩(wěn)定的促殺傷狀態(tài)。這為腫瘤浸潤(rùn)Treg細(xì)胞功能與穩(wěn)定性的研究提供了新的理論依據(jù)，也為以Treg內(nèi)信號(hào)環(huán)路作為靶點(diǎn)增強(qiáng)抗腫瘤免疫提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：[1]Liu X, Zhang W, Han Y, et al. FOXP3+ regulatory T cell perturbation mediated by the IFNγ-STAT1-IFITM3 feedback loop is essential for anti-tumor immunity. Nat Commun. 2024;15(1):122. Published 2024 Jan 2. doi:10.1038/s41467-023-44391-9
 

賽業(yè)小鼠模型構(gòu)建

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Ifitm3 KO小鼠

品系名稱：C57BL/6JCya-Ifitm3em1/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：S-KO-11551
應(yīng)用方向：細(xì)胞,免疫等

Ifitm3 flox小鼠

品系名稱：C57BL/6JCya-Ifitm3em1flox/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：S-CKO-12902
應(yīng)用方向：細(xì)胞,免疫等

Stat1 KO小鼠

品系名稱：C57BL/6JCya-Stat1em1/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：S-KO-04562
應(yīng)用方向：代謝,免疫,腫瘤等

Stat1 flox小鼠

品系名稱：C57BL/6JCya-Stat1em1flox/Cya
產(chǎn)品編號(hào)：S-CKO-05336
應(yīng)用方向：代謝,免疫,腫瘤等