隨著科學(xué)研究的不斷深入，對(duì)顯微鏡技術(shù)的要求也日益提高。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡雖然廣泛應(yīng)用，但在成像深度和分辨率方面逐漸難以滿足前沿研究的需求。而雙光子熒光（TPF）顯微成像技術(shù)的出現(xiàn)，打開了一扇通往更高分辨率和更深成像深度的大門。這種技術(shù)基于非線性光學(xué)效應(yīng)，具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，使其在眾多顯微成像技術(shù)中脫穎而出，成為化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

河北工業(yè)大學(xué)張澤團(tuán)隊(duì)利用飛秒激光器作為激發(fā)光源，搭建了TPF顯微成像系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)測(cè)量了TPF光譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠大腦切片的激發(fā)，開展了小鼠大腦切片的斷層掃描成像與三維重構(gòu)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中采用主客觀分析相結(jié)合的研究方法，通過(guò)對(duì)三維圖像的觀測(cè)后再對(duì)樣品關(guān)鍵部位的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析，可以快速鎖定研究區(qū)域。在以往的成像研究中常采用直接觀察圖像并結(jié)合光譜的方法對(duì)樣品中特定細(xì)胞或組織進(jìn)行定性的分析，卻少有研究通過(guò)處理強(qiáng)度分布數(shù)據(jù)來(lái)對(duì)樣品的關(guān)鍵部位進(jìn)行定量的分析。

成像理論與實(shí)驗(yàn)
一、成像理論基礎(chǔ)
1.雙光子熒光空間分布
通過(guò)對(duì)高斯光束復(fù)振幅在空間中的分布進(jìn)行分析，推導(dǎo)出TPF信號(hào)的縱向與徑向分布公式，揭示了TPF信號(hào)強(qiáng)度在空間中的變化規(guī)律，為理解成像系統(tǒng)的分辨率和成像深度提供了理論依據(jù)。

2.成像深度與分辨率
成像深度與激發(fā)光在組織中的散射長(zhǎng)度、熒光量子效率、熒光收集效率以及激發(fā)光脈沖的重復(fù)頻率和脈沖寬度等有關(guān)，通過(guò)合理調(diào)整這些參數(shù)，可以增加成像深度。而分辨率方面，橫向分辨率與激發(fā)光波長(zhǎng)、物鏡數(shù)值孔徑等因素相關(guān)，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算出本實(shí)驗(yàn)中成像系統(tǒng)的理論橫向分辨率為453nm，縱向分辨率為2.087μm。

2.小鼠大腦切片的TPF顯微成像實(shí)驗(yàn)操作步驟
首先測(cè)量羅丹明B溶液的TPF光譜，選擇合適的探測(cè)窗口。在進(jìn)行小鼠大腦切片成像時(shí)，將樣品放置于電動(dòng)平臺(tái)，調(diào)整焦距和增益檔位，選擇成像區(qū)域。通過(guò)掃描光路對(duì)樣品進(jìn)行二維掃描，激發(fā)熒光并采集信號(hào)，最后由電腦處理得到顯微成像結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，還對(duì)不同激發(fā)功率下的成像結(jié)果進(jìn)行分析，研究熒光強(qiáng)度與激發(fā)功率的關(guān)系。

研究結(jié)論
一、成像系統(tǒng)性能參數(shù)的精確測(cè)定
1.成像深度的深度剖析
通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析，確定了成像系統(tǒng)的成像深度。數(shù)值的得出并非偶然，而是在對(duì)小鼠大腦切片進(jìn)行細(xì)致的三維重構(gòu)實(shí)驗(yàn)以及對(duì)樣品關(guān)鍵部位熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)深入分析的基礎(chǔ)上獲得的。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們從樣品表面到14μm深度范圍內(nèi)對(duì)小鼠大腦切片沿Z軸進(jìn)行了斷層掃描成像，每采集一次圖像向下移動(dòng)1μm的距離，如同在微觀世界中逐層揭開大腦的神秘面紗。

通過(guò)對(duì)不同深度處熒光強(qiáng)度的精確測(cè)量和分析，我們發(fā)現(xiàn)隨著深度的增加，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，而在12.9μm深度之后，成像系統(tǒng)采集到的信號(hào)主要為噪聲，這表明該深度是成像系統(tǒng)能夠有效獲取有用信息的極限，從而準(zhǔn)確界定了成像深度。這一成像深度的確定為我們?cè)谘芯啃∈蟠竽X以及其他類似生物樣品時(shí)提供了一個(gè)重要的參考指標(biāo)，幫助我們了解該成像系統(tǒng)能夠深入探測(cè)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的程度。

2.橫向分辨率的精準(zhǔn)評(píng)估
采用了一種巧妙的方法：在小鼠大腦切片樣品中尋找不含組織細(xì)胞的狹窄縫隙，通過(guò)分析成像結(jié)果中這些縫隙位置的強(qiáng)度分布曲線，確定能夠分辨的最小距離，從而得出橫向分辨率。盡管實(shí)驗(yàn)中得到的橫向分辨率數(shù)值大于理論計(jì)算的453nm，但這一結(jié)果仍然反映了成像系統(tǒng)在實(shí)際應(yīng)用中的分辨能力。由于樣品中可能不存在間距剛好為最小分辨率的理想縫隙，所以實(shí)際測(cè)量值會(huì)受到一定限制，但這也為我們進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法和提高分辨率提供了方向。

二、小鼠大腦微觀結(jié)構(gòu)成像的重要發(fā)現(xiàn)
1.灰質(zhì)與白質(zhì)分布的清晰呈現(xiàn)
實(shí)驗(yàn)清晰地展示了小鼠大腦中灰質(zhì)與白質(zhì)在不同深度的分布情況。在樣品表面，灰質(zhì)部分相較于白質(zhì)具有更高的熒光強(qiáng)度，這一現(xiàn)象表明灰質(zhì)在該區(qū)域可能具有更為活躍的分子活動(dòng)或者更高的物質(zhì)密度。隨著深度的增加，灰質(zhì)部分的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，而白質(zhì)部分的熒光強(qiáng)度開始增加，在3μm的深度，白質(zhì)的熒光強(qiáng)度開始高于灰質(zhì)部分，在6μm的深度，灰質(zhì)部分的熒光信號(hào)幾乎消失，強(qiáng)度僅為白質(zhì)部分的1/18。

這一系列變化揭示了小鼠大腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和層次性。灰質(zhì)主要存在于樣品的淺層，這與灰質(zhì)在大腦中承擔(dān)的重要功能密切相關(guān)，如信息處理、認(rèn)知和感知等功能可能主要在淺層灰質(zhì)區(qū)域進(jìn)行。而白質(zhì)部分厚度更大且縱向分布更廣，這與白質(zhì)在大腦中負(fù)責(zé)神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的功能相契合，其廣泛的分布有助于在大腦不同區(qū)域之間快速傳遞信息。

2.熒光強(qiáng)度變化與大腦功能的潛在關(guān)聯(lián)
灰質(zhì)和白質(zhì)熒光強(qiáng)度隨深度的變化不僅僅是簡(jiǎn)單的光學(xué)現(xiàn)象，更可能與大腦的生理功能有著緊密的聯(lián)系�；屹|(zhì)熒光強(qiáng)度在淺層較高可能意味著該區(qū)域神經(jīng)元活動(dòng)頻繁，需要更多的能量和物質(zhì)交換，從而導(dǎo)致較高的熒光信號(hào)。而隨著深度增加熒光強(qiáng)度減弱，可能反映出隨著信號(hào)傳遞到大腦更深層次，神經(jīng)元活動(dòng)方式或物質(zhì)代謝發(fā)生了變化。

白質(zhì)熒光強(qiáng)度在一定深度增加，可能是由于隨著深度增加，神經(jīng)纖維束的結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，影響了熒光物質(zhì)的分布和激發(fā)效率。這些熒光強(qiáng)度的變化為我們理解大腦功能的分區(qū)和神經(jīng)信號(hào)傳遞機(jī)制提供了新的線索，有助于進(jìn)一步研究大腦在正常生理狀態(tài)以及疾病狀態(tài)下的功能變化。

展望未來(lái)
一、對(duì)神經(jīng)科學(xué)研究的深遠(yuǎn)影響
為神經(jīng)科學(xué)研究提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具和新的視角，有助于我們更深入地理解哺乳動(dòng)物大腦的微觀結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元作用機(jī)制。通過(guò)清晰地呈現(xiàn)小鼠大腦灰質(zhì)和白質(zhì)的分布以及它們?cè)诓煌�深度的熒光�?qiáng)度變化，我們能夠更準(zhǔn)確地構(gòu)建大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的三維模型，進(jìn)一步了解神經(jīng)元之間的連接方式、信息傳遞路徑以及突觸可塑性等關(guān)鍵問題，這對(duì)于揭示大腦的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)功能的神經(jīng)基礎(chǔ)具有重要意義。

在神經(jīng)疾病研究領(lǐng)域，通過(guò)對(duì)患病小鼠大腦的成像研究，可以觀察到疾病狀態(tài)下大腦微觀結(jié)構(gòu)的異常變化，如灰質(zhì)萎縮、白質(zhì)病變等情況，從而深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制。例如，在阿爾茨海默病研究中，我們可以利用該技術(shù)追蹤神經(jīng)元之間的連接受損情況，以及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞過(guò)程中的異常變化，為疾病的早期診斷、藥物研發(fā)和治療效果評(píng)估提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

二、推動(dòng)成像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展
對(duì)成像系統(tǒng)性能參數(shù)的測(cè)定以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的問題，為后續(xù)成像技術(shù)的優(yōu)化提供了明確的方向。同時(shí)，針對(duì)成像深度的進(jìn)一步提升，我們可以研究新型的激光源或光學(xué)元件，優(yōu)化光路設(shè)計(jì)，減少光在組織中的散射和吸收，從而增加成像深度。此外，提高成像速度也是一個(gè)重要的研究方向，這將有助于在活體生物樣品研究中捕捉更快速的生理過(guò)程，如神經(jīng)信號(hào)的動(dòng)態(tài)傳遞等。

未來(lái)，TPF顯微成像技術(shù)有望與其他先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行融合，產(chǎn)生更強(qiáng)大的研究工具。例如，與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，我們可以對(duì)特定神經(jīng)元群體進(jìn)行標(biāo)記和功能調(diào)控，然后利用TPF顯微成像技術(shù)實(shí)時(shí)觀察這些神經(jīng)元在生理和病理狀態(tài)下的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)大腦功能的精準(zhǔn)解析。與光遺傳學(xué)技術(shù)融合，可以在對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行光學(xué)刺激的同時(shí)進(jìn)行高分辨率成像，研究神經(jīng)元活動(dòng)與行為之間的因果關(guān)系。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于：張澤,侯國(guó)忠,鄧巖巖,章媛,張德林,李兢兢,王雨雷,呂志偉,夏元?dú)J.小鼠大腦飛秒雙光子熒光三維顯微成像研究[J]. 紅外與激光工程,2023,52(8):20230201.DOI:10.3788/IRLA20230201.