原創(chuàng)為：烏拉烏拉 來源于：生物制藥小白

概述

本文概述了噬菌體展示技術(shù)在展示、篩選、策略等方面的進(jìn)展，是一篇值得進(jìn)一步深入探究的綜述。后續(xù)公眾號會依照本文對噬菌體展示技術(shù)的各部分進(jìn)行經(jīng)典文獻(xiàn)內(nèi)容提取展示。主要內(nèi)容概述如下：

1、抗原展示：直接或間接固定展示；通過脂質(zhì)體、納米盤和 VLPs 展示；全細(xì)胞淘選展示

2、篩選技術(shù)：負(fù)篩（抗原標(biāo)簽、載體、脂質(zhì)體、納米盤和 VLPs、全細(xì)胞、表位特異性去除、復(fù)雜抗原混合物的去除 ）、競爭篩選、交叉淘選、抗體阻斷、NGS技術(shù)、共同抗原、環(huán)境名感條件篩選

3、特殊文庫設(shè)計：雙特異性文庫、共同輕鏈文庫、共同重鏈文庫、CDR-H3文庫、側(cè)-環(huán)文庫、組氨酸富集文庫、

4、一般文庫設(shè)計重點：抗原免疫原性要求、多樣性要求、文庫側(cè)重設(shè)計（擴增特定種系、刪除不利種系、刪除某些影響工藝的序列等）

正文

簡介

噬菌體展示技術(shù)最早發(fā)明于 1985 年，用于展示多肽，后來在 1990 年，第一個抗體片段被展示在噬菌體上。從那時起，該技術(shù)已成功用于發(fā)現(xiàn)數(shù)百種抗體，用于研究、診斷和治療，其中超過 14 種抗體獲得臨床批準(zhǔn)。噬菌體展示方法的各個方面都得到了改進(jìn)和提高，從而能夠發(fā)現(xiàn)針對具有挑戰(zhàn)性靶點的抗體和具有特定結(jié)合特性的抗體。與其他展示技術(shù)相比（如核糖體、酵母或哺乳動物展示技術(shù)），噬菌體展示的優(yōu)勢之一是可以創(chuàng)建大型文庫（多樣性大于 10 的 11 次方個獨特的克�。┎⒋鎯σ詡溥x擇，從而可以發(fā)現(xiàn)針對廣泛抗原的高親和力抗體。在本綜述中，我們將討論四個主要參數(shù)，這四個主要參數(shù)可以通過優(yōu)化來改善抗體發(fā)現(xiàn)活動的結(jié)果：抗體展示形式的選擇、抗原展示、選擇策略和文庫構(gòu)建。

噬菌體展示文庫中使用的抗體形式

噬菌體展示文庫可以使用不同的噬菌體來展示各種不同的抗體形式，如絲狀 M13、fd 和 f1 噬菌體。兩種最常用的形式是單鏈可變片段(scFvs) 和抗原結(jié)合片段 (Fabs)。ScFvs 是由 VH 和 VL 結(jié)構(gòu)域通過短的多肽連接子組成的小型（25-27 kDa）單價抗體片段。Fabs 大小為 50 kDa，由 VH、VL、CL 和 CH1 結(jié)構(gòu)域組成。ScFv 轉(zhuǎn)換為 Fab/IgG 形式時可能會失去親和力，這點在以 Fab 形式發(fā)現(xiàn)的抗體上則很少出現(xiàn)。但是，F(xiàn)ab 通常比 scFvs 的表達(dá)率低，在噬菌體上的展示水平也較低，因此，scFvs 是一種更穩(wěn)健的文庫形式，尤其是在天然庫中。

其他抗體形式也可用于構(gòu)建抗體噬菌體展示文庫，包括人單域抗體（人 VH）以及駝科和鯊魚單域抗體（分別為 VHH 和 VNAR）。VHHs 較小(12-15 kDa），由純重鏈抗體的抗原結(jié)合片段組成。在傳統(tǒng)抗體中，介導(dǎo) VH 和 VL 配對的界面包含被掩埋在界面中的疏水殘基。在 VHHs 中，這些殘基被親水性更強的殘基所取代，從而提高了水溶性，降低了形成聚集體的趨勢。與傳統(tǒng)抗體相比，VHH 中的互補性決定區(qū) 3（CDR3）環(huán)通常被拉長，這使得 VHH 能夠結(jié)合傳統(tǒng)抗體不能結(jié)合的抗原，如酶活受體結(jié)構(gòu)域的催化區(qū)域。VNAR 抗體片段在大小上與 VHH 抗體片段相似，但有一個明顯的例外，即它只有兩個 CDR 環(huán)，因為 Fr2- CDR2 區(qū)域的大部分被刪除了。

在噬菌體展示活動中選擇哪種抗體形式取決于所發(fā)現(xiàn)抗體的最終用途。如果應(yīng)用是治療性的且需要長半衰期，或者需要效應(yīng)細(xì)胞的參與，scFv 或 Fab 庫可能是最佳選擇，因為它們可以很容易地重新轉(zhuǎn)換為常用的治療用 IgG 形式。對于研究試劑和診斷應(yīng)用，或者當(dāng)大規(guī)模生產(chǎn)的成本是主要考慮的問題時，VHH 等形式可能是最理想的選擇，盡管這種形式也可以與 Fc 區(qū)域融合，形成 VHH-Fc 分子，在半衰期和效應(yīng)細(xì)胞參與方面具有與 IgG 相似的特性�？傊�，明確最終抗體產(chǎn)品的要求對于選擇最合適的庫類型至關(guān)重要。

抗原展示策略

對于一個成功的基于噬菌體展示的抗體發(fā)現(xiàn)項目來說，所含抗原的構(gòu)象必須與最終應(yīng)用中抗原的構(gòu)象相似。否則，發(fā)現(xiàn)的抗體最終只能識別改變了構(gòu)象的抗原。因此，噬菌體展示活動的第一步也是關(guān)鍵的一步是確定抗原展示的最佳方法。

1、通過直接或間接固定進(jìn)行抗原展示

最廣泛使用的抗原展示策略是將抗原直接或間接的固定在表面上（圖 1a）。在直接固定法中，抗原通過被動吸附涂布在表面上。這種方法是迄今為止最簡單的抗原展示方法；但它并不適合許多其他類型的抗原，因為這些抗原在吸附后會改變其原生構(gòu)象。對于小抗原來講這種方法存在特別大的問題，因為該方法不能完全展示分子間的相互作用力以發(fā)揮被動吸附作用。對于上述抗原的其中一部分來講，間接固定法可用來替代直接固定法。

通過間接固定，抗原被一種捕獲分子捕獲到表面。最流行的技術(shù)是利用鏈霉親和素/中性親和素與生物素之間的強結(jié)合力，在表面包被鏈霉親和素/中性親和素，抗原通過連接子或標(biāo)簽與生物素結(jié)合。這會使得抗原與表面有間接且穩(wěn)定的結(jié)合。間接固定法更能使抗原最大程度的保留原始構(gòu)象，因為抗原是突出于篩選表面的。然而，至關(guān)重要的是不要使抗原過度生物素化，因為這會掩蓋重要的表位或?qū)е驴乖�聚集�?/p>

生物素化有兩種不同的方法：位點特異生物素化和隨機生物素化。位點特異生物素化可以使用包含酶生物素化位點的生物素化受體多肽（BAPs）來實現(xiàn)。AviTag 是最常用的一種 BAPs，需要將抗原與 15 個氨基酸多肽的標(biāo)簽融合并重組表達(dá)。AviTag 序列的生物素化發(fā)生在賴氨酸殘基上，通過大腸桿菌生物素酶 BirA 實現(xiàn)的。AviTagged 抗原可在細(xì)菌細(xì)胞、酵母和哺乳動物細(xì)胞中與 BirA 共同表達(dá)，以實現(xiàn)體內(nèi)生物素化。此外，純化的AviTagged 抗原可以和純化的 BirA 以及生物素共孵育，實現(xiàn)體外生物素化。利用 BAPs 的生物素化是位點特異性的，每個抗原只有一個生物素，因此可以控制抗原生物素的比例，避免過度生物素化。盡管如此，在某些情況下可能無法使用 AviTag 系統(tǒng)，特別是目標(biāo)抗原難以或無法重組表達(dá)時，或 AviTag 會干擾抗原的潛在的重要（末端）表位時。

隨機化學(xué)生物素化法可作為 BAP 生物素化的替代方法。在這種方法中，純化的抗原和生物素化試劑通過各種可能的化學(xué)反應(yīng)混合，以實現(xiàn)抗原和生物素之間的共價連接。有多種連接子可供選擇，可連接生物素化抗原的主要胺基（賴氨酸 N末端或側(cè)鏈）或巰基和羧基。雖然化學(xué)生物素化比酶法生物素化（通過大腸桿菌生物素連接酶）更快、更便宜，但其需要滴定才能達(dá)到所需的 1:1 的抗原生物素比例。

抗原的間接固定可基于不同的肽標(biāo)簽和標(biāo)簽特異性捕獲分子。這需要融合肽標(biāo)簽的抗原重組表達(dá)以及篩選表面和融合的標(biāo)簽特異性捕獲分子共包被。標(biāo)簽和捕獲分子間的結(jié)合導(dǎo)致抗原的固定。盡管與生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)相比，His-標(biāo)簽和抗-His抗體或其他 His 捕獲分子不那么流行，但它們已被用于噬菌體展示中的抗原展示。最近，從變形鏈球菌中的纖連蛋白結(jié)合蛋白中提取的肽-蛋白配體對，即 SpyTag/SpyCatcher，被用于噬菌體展示篩選中的抗原展示。Spy 標(biāo)簽和 Spy 捕獲分子之間的結(jié)合是通過異肽鍵實現(xiàn)的，在各種條件下，如 pH、溫度和緩沖體系中，都證實這是一種不可逆、特異且扎實的方法。

2、通過全細(xì)胞淘選進(jìn)行抗原展示

盡管間接固定適合于展示許多抗原，但當(dāng)它要展示膜蛋白等抗原時，往往不是最佳選擇。膜蛋白通常包含疏水跨膜區(qū)并且可能是多個亞單位蛋白復(fù)合體的一部分；因此，將他們從自然環(huán)境中分離后經(jīng)常會丟失原始構(gòu)象。為保持其構(gòu)象，膜蛋白可在細(xì)胞膜上表達(dá)（圖 1b）。哺乳動物細(xì)胞系，如人胚腎（HEK）細(xì)胞或中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞，可以瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染目標(biāo)蛋白，使其過度表達(dá)并在細(xì)胞表面獲得高密度，同時保留抗原的原生構(gòu)象。雖然有時會使用培養(yǎng)的原代細(xì)胞進(jìn)行篩選，但事實證明，與原代細(xì)胞相比，培養(yǎng)的細(xì)胞會改變蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；為克服這一潛在問題，可使用未經(jīng)培養(yǎng)的原代細(xì)胞進(jìn)行篩選。其他細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，包括大腸桿菌、酵母和昆蟲細(xì)胞，也可用于表達(dá)和呈現(xiàn)膜蛋白。

在全細(xì)胞上進(jìn)行噬菌體展示篩選的一個問題是，目標(biāo)抗原，無論是內(nèi)源的還是重組表達(dá)的，都只占展示文庫總蛋白的一小部分。為克服這一問題，可采用下文所述的負(fù)篩技術(shù)。此外，在使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，可在兩輪篩選之間改變宿主細(xì)胞，以集中篩選存在于兩種細(xì)胞上的重組抗原。另一個挑戰(zhàn)是噬菌體顆�？赏ㄟ^其外殼蛋白（與其展示的抗體片段無關(guān)）非特異性地吸附到細(xì)胞表面。為了解決此問題，洗脫時使用低 pH 的緩沖液。此外，一些噬菌體還能與用于淘洗的細(xì)胞懸液中的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片非特異性結(jié)合。為了減少這種非特異性 binder 的富集，需要確保篩選時所用的細(xì)胞是高活率的。

3、通過脂質(zhì)體、納米盤和 VLPs 展示抗原

膜蛋白也可以展示在兩親結(jié)構(gòu)上，如脂質(zhì)體、納米盤和病毒樣顆粒（VPLs）（圖 1c）。脂質(zhì)體是一種球形囊泡，由一個或多個磷脂雙分子層膜（通常由磷脂分子組成）所包圍的一定體積的水溶液組成。磷脂雙分子層膜模擬了質(zhì)膜的環(huán)境，為展示膜蛋白提供了一個合適的平臺。在脂質(zhì)體上展示的抗原需要形成脂質(zhì)體，從原生膜環(huán)境中提取抗原（無論是從天然來源分離還是重組表達(dá)），最后將提取的抗原轉(zhuǎn)移到預(yù)形成的脂質(zhì)體上。當(dāng)重組表達(dá)時，抗原需要與標(biāo)簽融合，以便后期純化。

膜蛋白還可以展示在納米盤上，是納米大小的圓盤結(jié)構(gòu)，由兩條兩親的螺旋蛋白帶（膜結(jié)構(gòu)蛋白，即 MSPs）包圍的磷脂雙分子層組成。純化的膜蛋白可與磷脂和 MSPs 混合以獲得攜帶膜蛋白的納米盤（圖 1c）。蛋白帶限制了雙分子層的大小，因此與脂質(zhì)體相比，納米盤的大小分布更加單分散和一致。此外，納米盤為膜蛋白提供了更穩(wěn)定的環(huán)境，與脂質(zhì)體相比可以保存更長時間。此外，由于其盤狀結(jié)構(gòu)，加入納米盤中的蛋白質(zhì)可從膜的兩側(cè)接觸到。這在需要接觸膜蛋白的細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域時非常有利。脂質(zhì)體和納米盤都可用于展示離子通道和多次跨膜蛋白，如離子通道和 G 蛋白偶聯(lián)受體，這些蛋白直到最近才被證明難以表達(dá)/純化。然而，脂質(zhì)體和納米盤都依賴去垢劑提取膜蛋白，這會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。作為一種無去垢劑的替代方法，使用苯乙烯馬來酸（SMA）共聚物可將膜溶解到脂質(zhì)納米盤中，這種納米盤是由 SMA 共聚物環(huán)繞的磷脂雙分子層組成的納米大小的盤狀結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)被稱為 "苯乙烯馬來酸-脂質(zhì)顆粒"（SMALP）。使用無去垢劑提取的蛋白也能融入脂質(zhì)體用于抗原展示。

細(xì)胞毒性蛋白過表達(dá)時可以引起宿主細(xì)胞的生長延遲和毒性，使該蛋白難以表達(dá)。細(xì)胞毒性蛋白和膜蛋白可以在無細(xì)胞的情況下進(jìn)行合成，合成反應(yīng)包括改良的細(xì)胞裂解液，它為目標(biāo)蛋白的表達(dá)提供了合適的環(huán)境，可能與模擬結(jié)構(gòu)（如脂質(zhì)體和納米盤）相結(jié)合，從而捕獲并展示新合成的蛋白。膜蛋白在納米盤上的展示已經(jīng)在噬菌體展示中應(yīng)用。

VLPs 是另一種適于噬菌體展示的膜蛋白的展示方法。VLPs 是非感染性的、類似病毒的多蛋白結(jié)構(gòu)，它沒有病毒的基因組，但含有病毒的衣殼蛋白。目標(biāo)膜蛋白可以瞬轉(zhuǎn)入表達(dá)衣殼蛋白的宿主細(xì)胞中，并在其表面過表達(dá)。自組裝的病毒衣殼蛋白引導(dǎo)質(zhì)膜出芽，從而形成綴滿目標(biāo)抗原的 VLPs（圖 1c）�？梢韵群铣� VLPs 隨后將目標(biāo)蛋白共價結(jié)合在其表面上。與脂質(zhì)體相比，VLPs 更為穩(wěn)定，能以更高的密度呈現(xiàn)抗原。不過，VLPs 的成本也很高，因為商業(yè)化的 VLPs 價格昂貴，而且在實驗室中生產(chǎn) VLPs也很費力。

先進(jìn)的噬菌體展示篩選策略

利用噬菌體展示篩選進(jìn)行抗體發(fā)現(xiàn)活動可以采用多種策略和方案。這些策略應(yīng)經(jīng)過仔細(xì)挑選，以最大限度地提高發(fā)現(xiàn)具有所需特征的抗體的機會。在這里，我們將介紹可用于發(fā)現(xiàn)具有結(jié)合特性（如交叉反應(yīng)、高選擇性或 pH 依賴性）的抗體的不同策略。

1、負(fù)篩策略：抗原標(biāo)簽和載體材料

在篩選過程中，針對所有抗原（包括標(biāo)簽或融合伙伴）以及支持基質(zhì)（如鏈霉親和素磁珠）的 binders 都有可能被篩選出來。為了克服這一問題，通常會使用非目標(biāo)物進(jìn)行負(fù)篩，以限制針對目標(biāo)物以外抗原的抗體的富集。例如，使用鏈霉親和素磁珠對生物素化蛋白進(jìn)行選擇之前，可以先將文庫暴露在與鏈霉親和素磁珠偶聯(lián)的生物素化的非目標(biāo)蛋白質(zhì)上，以減少進(jìn)入預(yù)期目標(biāo)篩選步驟的這類不需要的 binder 的比例（圖 2a）。

2、負(fù)篩策略：全細(xì)胞、脂質(zhì)體、納米盤和 VLPs

同樣的原理可應(yīng)用于更復(fù)雜的靶標(biāo)，如全細(xì)胞、脂質(zhì)體、納米盤或 VLPs。在對全細(xì)胞進(jìn)行淘選時，可使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法來表達(dá)需要展示的抗原，如感興趣的表面受體，然后使用模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來進(jìn)行負(fù)篩，富集受體特異性的抗體。此外，在發(fā)現(xiàn)針對病毒靶標(biāo)的抗體時，可以使用感染的宿主細(xì)胞作為抗原進(jìn)行篩選，未感染的宿主細(xì)胞裂解液用于。對于脂負(fù)篩。使用內(nèi)源性表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞時，最理想的是，使用敲除目標(biāo)抗原的相同細(xì)胞進(jìn)行負(fù)篩（圖2b）。對于脂質(zhì)體、納米盤和 VLPs 來講，也可采用類似策略，即在抗原展示顆粒上進(jìn)行篩選之前，先使用未嵌入抗原的展示顆粒進(jìn)行負(fù)篩。

更為復(fù)雜的情況是，在使用哺乳動物或細(xì)菌細(xì)胞的表型發(fā)現(xiàn)活動中，在事先不知道靶標(biāo)的情況下使用整個細(xì)胞進(jìn)行篩選。在這種情況下，可以在與靶細(xì)胞相似的非靶細(xì)胞上進(jìn)行負(fù)篩，以避免針對常見細(xì)胞表面抗原的富集。然而，像轉(zhuǎn)染細(xì)胞那樣的完美匹配是不可能的。例子包括，目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)靶向 B細(xì)胞上的抗體，使用 T 細(xì)胞進(jìn)行負(fù)篩。

3、負(fù)篩策略：復(fù)雜抗原混合物的去除

通過去除進(jìn)行的負(fù)篩可用于復(fù)雜靶標(biāo)，如全細(xì)胞或不純蛋白質(zhì)樣本，也可用于靶標(biāo)未知的情況。例如，在事先不知道靶點的情況下對全細(xì)胞進(jìn)行篩選。在這種情況下，盡管靶抗原是未知的，但非靶抗原可能是已知的，這樣就可以進(jìn)行蛋白去除篩選。在蛋白質(zhì)去除過程中，噬菌體展示文庫與包被或捕獲在免疫試管或磁珠上的非目標(biāo)抗原對應(yīng)的重組蛋白質(zhì)一起孵育。之后，未結(jié)合的噬菌體被轉(zhuǎn)移到目標(biāo)抗原上，并用于選擇。

4、負(fù)篩策略：表位特異性去除

對于治療性抗體來說，抗體與目標(biāo)抗原的哪個表位結(jié)合往往至關(guān)重要，因為這可以決定抗體是否具有治療價值。為了引導(dǎo)抗體與抗原的特定部分結(jié)合，可以采用不同的技術(shù)。為了找到受體的配體結(jié)合位點結(jié)合的 binders，可以通過加入高濃度配體來進(jìn)行洗脫，這樣只能洗脫出與配體競爭結(jié)合的抗體。然而，這種方法最大的弊端是主要是低親和力抗體被洗脫下來，需要使用特異性的減少低親和力 binders 量的方法�？贵w阻斷（Antibody blocking）也稱表位掩蔽（epitope masking）是另一種發(fā)現(xiàn)針對抗原特定部分抗體的策略。在篩選過程中，先前發(fā)現(xiàn)的與抗原非目的表位結(jié)合的抗體也會被納入阻斷范圍。這些抗體會結(jié)合并阻斷抗原的某些表位，使噬菌體上的新抗體在篩選步驟中無法接觸到某些表位。這樣，結(jié)合新表位的抗體就能得到富集（圖 2d）。除抗體外，受體-配體復(fù)合物也能以類似的方式去除那些與受體或配體一樣不識別位點相同位點的 binders。

5、競爭篩選

在許多情況下，希望減少與靶抗原相關(guān)抗原的結(jié)合力。因此，目標(biāo)是將篩選集中在目標(biāo)抗原獨有的表位上，減少與相關(guān)抗原共有表位的結(jié)合比例。然而，負(fù)篩并非百分之百有效，這與靶標(biāo)濃度和與共享表位結(jié)合的親和力有關(guān)�？贵w與抗原的結(jié)合是一種遵循質(zhì)量作用定律的平衡反應(yīng)。因此，并非所有抗體都能在特定時間點與抗原結(jié)合。因此，在所有的負(fù)篩策略中，有幾種抗體對用于負(fù)篩的抗原是具有特異性，但在負(fù)篩結(jié)束的時間點，這些抗體不會與抗原結(jié)合。因此，這些對用于的負(fù)篩抗原具有特異性的抗體將被帶到篩選階段，并可能在此與目標(biāo)抗原結(jié)合。為了避免這種情況，可以在存在競爭抗原的情況下進(jìn)行篩選（競爭篩選），作為負(fù)篩的替代方法（或與負(fù)篩相結(jié)合）。

在競爭篩選中，目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原與抗體庫混合，使抗體在目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原之間競爭結(jié)合。使用大量過量的非目標(biāo)抗原會促使抗體與目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原共有的表位結(jié)合，從而提高回收抗體中與目標(biāo)特異性表位結(jié)合的抗體比例。因此，在篩選步驟之后，與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體會被富集。用結(jié)合抗體收集靶標(biāo)的策略包括用生物素等標(biāo)記靶標(biāo)，而不標(biāo)記非靶標(biāo)（圖 3a）。這種方法可用于全細(xì)胞和純化的蛋白。另一種方法是以不同方式呈現(xiàn)靶抗原和非靶抗原，如將靶抗原固定或包被在塑料表面，然后在溶液中加入非靶抗原（圖 3b）。對于全細(xì)胞篩選來講，非目標(biāo)細(xì)胞也可作為膜顆粒呈現(xiàn)，從而產(chǎn)生不同密度的目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原，這樣就可以通過離心進(jìn)行分離。

與健康樣本相比，病變組織、細(xì)胞和體液中的抗原上調(diào)通常是治療或診斷的相關(guān)靶點。另一種發(fā)現(xiàn)這些靶點和靶向上述靶點的抗體的方法是利用表型篩選。然而，在這種情況下，使用健康樣本的經(jīng)典負(fù)篩策略并不理想，因為，在負(fù)篩步驟中（健康樣本表面），所有抗原的 binders 都會減少。相反，在篩選期間包含競爭篩選可以發(fā)現(xiàn)這些上調(diào)靶點的抗體，不僅僅是那些特異性表達(dá)的靶點。通過改變用于競爭的非靶標(biāo)抗原的添加量，這些篩選可以幫助發(fā)現(xiàn)針對上調(diào)到一定程度的靶標(biāo)的抗體�？贵w將與展示在目標(biāo)抗原和非目標(biāo)抗原上的抗原競爭結(jié)合，表達(dá)水平將決定抗體是主要被富集還是被清除（圖 3c）。

產(chǎn)生交叉反應(yīng)抗體的策略

抗體是高度特異性的分子，篩選通常是為了找到特異的抗體，使其結(jié)合一種目標(biāo)抗原，避免與其他分子結(jié)合。然而，在許多情況下，盡管抗體必須對目標(biāo)具有高度特異性，但它們也傾向于結(jié)合同一靶標(biāo)的同源物或不同突變版本。例如，如果能識別該抗原的小鼠和猴的同種抗原，那么同時與人源靶點結(jié)合的治療抗體的臨床前研究就會更容易進(jìn)行。另一個例子是，感染性疾病和抗蛇毒素的開發(fā)，識別不同病毒、細(xì)菌或毒素的廣泛性中和抗體被發(fā)現(xiàn)就更有益。

1、交叉淘選

實現(xiàn)交叉反應(yīng)的一種方法是進(jìn)行交叉淘選，這種方法可以在篩選過程的不同輪次鐘改變抗原（圖 4a）。這種技術(shù)已被用于尋找針對艾滋病毒、流感病毒 A 株以及多種物種的蛇毒細(xì)胞毒的保守表位的抗體。成功與否取決于相關(guān)靶標(biāo)之間的保守程度。對保守程度低的同源物或類似物需要廣泛的交叉反應(yīng)，可能會導(dǎo)致找到低親和力的抗體、非特異性結(jié)合抗體或無抗體。

2、抗體阻斷和下一代測序

當(dāng)同一抗原被用于重復(fù)淘選時，為了發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體，可利用上文所述的抗體阻斷法引導(dǎo)淘選指向抗原的保守表位（圖 4b）。另一種方法是利用下一代測序技術(shù)（NGS）評估非同源蛋白平行篩選時的產(chǎn)出，以鑒定所有產(chǎn)出池中富集和發(fā)現(xiàn)的抗體（圖 4c）。這種方法用于發(fā)現(xiàn)結(jié)合血清白蛋白的 binders。

3、共同抗原

鑒別交叉反應(yīng)抗體的另一種方法是在篩選中使用共同抗原（圖 4d）。共同抗原的設(shè)計方法是對多個同源抗原進(jìn)行序列整合，并構(gòu)建一個 "平均 "的共同抗原，在每個位點使用最常見的氨基酸。在有多個氨基酸選擇存在的位點上，可以采用不同的方法，例如基于相似的化學(xué)特性或篩選氨基酸，或選擇具有最佳預(yù)測免疫原性的氨基酸。利用共同毒素對馬進(jìn)行免疫，成功地產(chǎn)生了針對不同蛇的短神經(jīng)毒素的多克隆廣譜中和抗體，并推測使用共識抗原可能會在基于噬菌體展示的抗體發(fā)現(xiàn)活動中非常有用。

4、篩選環(huán)境敏感的抗體

在注射治療抗體時，抗體在被細(xì)胞內(nèi)吞前一直處于循環(huán)狀態(tài)。內(nèi)吞后，抗體被引導(dǎo)至溶酶體，在那里它們可以被再次釋放至循環(huán)中，因為與新生兒受體（FcRn）結(jié)合。然而，當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時，抗原-抗體復(fù)合物被內(nèi)化，要么在溶酶體內(nèi)降解，要么被再次投入循環(huán)。為了避免抗原或者不需要的抗體碎片循環(huán)，可以將抗體改構(gòu)成在酸性內(nèi)體中從抗原上釋放，當(dāng)抗體進(jìn)入循環(huán)時抗原則被降解（圖5a）。對于治療性抗體來講，這樣改構(gòu)可以降低藥物的給藥劑量或者給藥頻率。鑒于血液循環(huán)（pH7.4）和內(nèi)含體（pH5.8））的 pH 不同，我們需要的是在不同 pH 對抗原有不同親和力的抗體，這樣抗體就會在非載模式下進(jìn)入循環(huán)。與傳統(tǒng)抗體相比，使用 pH 依賴的抗體可降低血漿中的抗原濃度，該抗體還可以被設(shè)計為 FcRn 親和力增加版本的抗體。此外，pH 依賴的結(jié)合可增強抗體藥物偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性，并可能促進(jìn)抗體穿過血腦屏障。為發(fā)現(xiàn)依賴 pH 的抗體，可對噬菌體篩選步驟進(jìn)行修改，以豐富這一特性。在篩選過程中，中性 pH 值時產(chǎn)生結(jié)合，隨后將 pH 降至 5.4，使得依賴 pH 值的結(jié)合體被洗脫。使用富含組氨酸的文庫可以提高發(fā)現(xiàn) pH 依賴的 binder 的機會，文章后續(xù)會詳細(xì)說明。

提高抗體半衰期的另一個策略是使抗體的結(jié)合依賴于離子的存在。在內(nèi)涵體和血漿中，鈣離子的濃度存在差異。因此，在同樣 pH 依賴的條件下，鈣離子依賴可以被用于將抗體從內(nèi)體中循環(huán)出來。例如，在含鈣緩沖液中篩選 IL-6R，然后加入 EDTA 來螯合 Ca2+，從而將鈣依賴性抗體洗脫下來，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一種能加速清除血漿中抗原的抗體。

根據(jù)抗體的最終用途，可在篩選過程中附加額外要求，如提高穩(wěn)定性或減慢清除率。一種增加穩(wěn)定性的方法是增加溫度或者在篩選過程中增加蛋白酶，用以富集在上述條件下穩(wěn)定的抗體。在發(fā)現(xiàn)慢速解離抗體時，通常會在連續(xù)的篩選步驟中降低抗原濃度，并添加額外的洗滌步驟。

體內(nèi)噬菌體展示篩選

如前所述，使用全細(xì)胞作為抗原進(jìn)行噬菌體展示篩選是一種有效的策略，它能兼顧抗原的正確折疊、翻譯后修飾和功能性等諸多方面。然而，活體生物體內(nèi)抗原的復(fù)雜性和藥理學(xué)仍是空白。由于組織微環(huán)境的變化，相似的細(xì)胞類型可能會有完全不同的表達(dá)譜或翻譯后修飾，無論是在健康組織還是在患病組織。

為了完全模擬抗原的體內(nèi)圖譜，開發(fā)了體內(nèi)噬菌體展示技術(shù)。噬菌體展示庫通常是靜脈注射并讓其循環(huán)，然后進(jìn)行心內(nèi)灌注，清除未結(jié)合的噬菌體。最后，將噬菌體從收獲的勻漿或裂解的靶組織中釋放出來，并進(jìn)行測序分析。如果感興趣的靶點是已知的，則可在測序前分析抗體與靶點的結(jié)合情況。通過比較目標(biāo)組織中存在的序列與輸入組織或無關(guān)組織中存在的序列，確定噬菌體的富集程度，并選擇富集序列作進(jìn)一步鑒定（圖 6）。

圖6

在描述體內(nèi)噬菌體展示篩選的原始文獻(xiàn)中，基于肽的噬菌體展示文庫被用于確定與腦或腎血管特異性結(jié)合的肽。利用這種技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了 scFvs 和單域抗體（sdAbs）形式的抗體。體內(nèi)噬菌體展示主要在小鼠或大鼠身上進(jìn)行，但也有少數(shù)研究描述了該技術(shù)在人身上的應(yīng)用。然而，在人身上不可能進(jìn)行心內(nèi)灌注，因為這會導(dǎo)致受試者死亡。為了指定特異性靶向目的組織的序列，需要對血液中的噬菌體進(jìn)行分析和比較。

抗體噬菌體展示文庫的設(shè)計

如上所述，可根據(jù)所需抗體的最終要求，采用不同的篩選策略進(jìn)行選擇。除了所使用的篩選方法外，還可以使用各種噬菌體展示文庫來優(yōu)化獲得具有所需特征的抗體的機會。文庫可以基于不同的抗體形式、天然的或合成的抗體序列，甚至可以定制為具有特定生物物理或結(jié)合特性的抗體。在文庫構(gòu)建過程中，可以采用不同的克隆策略，如輕鏈和重鏈序列的連續(xù)克隆、重疊延伸 PCR 剪接或金門克隆來連接 VH 和 VL。在此，我們將介紹一些常規(guī)文庫類型以及更先進(jìn)的定制文庫設(shè)計。

根據(jù)構(gòu)建文庫所用抗體序列的來源，抗體噬菌體展示文庫總體上可分為兩大類：天然文庫和合成文庫。直接從 B 細(xì)胞或利用從頭合成技術(shù)合成獲得序列。

1、天然文庫

天然文庫捕捉供體的抗體庫，可以來自特異性免疫或非免疫（"天然"）供體�？乖�挑戰(zhàn)后的免疫反應(yīng)伴隨著抗體從幼稚 IgM 到分泌型 IgG 的類別轉(zhuǎn)換。因此，天然抗體庫通常從健康供體的 IgM 庫中產(chǎn)生，以捕獲多樣化的抗體群。相比之下，反映供體近期免疫史的 IgG 譜系則用于免疫庫。通過體細(xì)胞高頻突變進(jìn)一步驅(qū)動免疫應(yīng)答，從而使親和力、表達(dá)水平和抗體特異性得到改善。因此，平均而言，從免疫庫中發(fā)現(xiàn)的抗體比直接從天然庫中分離的抗體具有更高的親和力。然而，抗體工程技術(shù)能將從天然庫中獲得的抗體優(yōu)化成直接從免疫庫中獲得的抗體類似的水平。另一個區(qū)別是，免疫文庫通常體量較小，只能有效用于發(fā)現(xiàn)針對免疫的抗原或密切相關(guān)抗原的抗體，而天然文庫的應(yīng)用范圍更廣。由于重鏈和輕鏈以及有時 CDR 區(qū)域是隨機組合的，沒有考慮到天然配對，因此天然庫和免疫天然文庫的多樣性都超出了本身的多樣性。

2、合成文庫

合成文庫可以用多個框架和隨機 CDRs 從頭創(chuàng)建，也可以根據(jù)天然抗體序列合成抗體中的特定目的區(qū)域，通常是最有可能參與抗原結(jié)合的 CDR 環(huán)。合成文庫和天然文庫在用于抗體發(fā)現(xiàn)方面各有利弊，下面將重點介紹。

（1）抗原免疫原性要求

創(chuàng)建免疫庫需要用相關(guān)抗原進(jìn)行免疫。這就要求抗原具有免疫原性，這也是為什么除非從（自然）感染的病人身上清除 B 細(xì)胞，否則無法有效創(chuàng)建基于人類供體的人類抗原免疫庫。因此，構(gòu)建有效的人抗原免疫文庫一般需要使用直系同源物種。出于治療目的，這種異源抗體必須在發(fā)現(xiàn)后進(jìn)行 "人源化 "。然而，人源化可能會導(dǎo)致抗體效力的抵消，因為不能完全去除原始抗體中對結(jié)合至關(guān)重要的殘基。另外，針對自身抗原的全人源庫現(xiàn)在也可以通過免疫人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行構(gòu)建。

天然庫與合成庫一樣，沒有抗原免疫原性要求，可用于發(fā)現(xiàn)針對所有類型抗原的抗體，包括高度保守的自身抗原以及對宿主有毒的抗原。

（2）文庫設(shè)計

這么多年以來，利用天然庫進(jìn)行噬菌體展示篩選活動發(fā)現(xiàn)了許多治療性抗體。對治療性抗體的要求包括高穩(wěn)定性和低聚集傾向。這些特性可以使抗體在高濃度時成給藥制劑，聚集低風(fēng)險一般與免疫原性相關(guān)。總的來講，抗體的生物物理特性可用于預(yù)測其開發(fā)成治療藥物的難易程度，這些特性統(tǒng)稱為抗體的 "成藥性 "。

在某種程度上，B 細(xì)胞的成熟過程會淘汰表現(xiàn)不佳的抗體，因為 B 細(xì)胞的活力是通過與表面表達(dá)的 B 細(xì)胞受體水平成比例的補充信號來維持的。然而，免疫來源的抗體并不能保證好的成藥性。自然界并不要求單個抗體在血清中的濃度達(dá)到抗體藥物制劑可能需要的水平，抗體藥物制劑通常需要 100 毫克/毫升左右的濃度。因此，無論抗體來源如何，在臨床前/臨床開發(fā)過程中，當(dāng)需要更高濃度的抗體時，生物物理特性有時就會出現(xiàn)。

在文庫構(gòu)建過程中，根據(jù)所選引物從供體淋巴細(xì)胞中擴增特定種系，可提高成藥性。然而，引物與不利種系的重疊仍可能發(fā)生。在合成庫中，利用臨床證實的框架和配對的VH-VL 種系可以改善成藥性。另外，種系的框架區(qū)并非在所有人中都保守，例如 VH4b，可在設(shè)計文庫時去除該種系。

最后，去除可能影響抗體均一性和下游生產(chǎn)的序列缺陷也是有益的。序列缺陷包括 NXS 糖基化位點；脫氨基 NG、NS 和 NA 基序；DG 異構(gòu)化；以及 M/C 氧化位點。序列缺陷的風(fēng)險對于抗體的結(jié)合和功能非常重要，抗體結(jié)合部位的序列缺陷數(shù)量增加則上述風(fēng)險增加。與天然文庫相比，通過對合成文庫中氨基酸的位點特異性控制，可以最大限度地減少這些與天然庫相關(guān)的基團(tuán)的出現(xiàn)，從而節(jié)省下游工程設(shè)計的時間。

（3）文庫多樣性

發(fā)現(xiàn)針對所需表位的治療性抗體的核心是最大限度地提高噬菌體展示文庫中捕獲的序列多樣性。免疫文庫利用體內(nèi)的天然多樣性和親和力成熟過程，富集與用于免疫的抗原特異性結(jié)合的抗體，但其使用僅限于針對該抗原和與其密切相關(guān)抗原的抗體發(fā)現(xiàn)活動。相比之下，如果無偏愛的天真庫和合成庫足夠大，則可用于發(fā)現(xiàn)針對任何感興趣抗原的結(jié)合體。

第一代天然庫通過增加供體的數(shù)量將多樣性最大化。人與人之間共享的公共克隆、抗體序列的存在影響了第一代原始文庫的真正多樣性。因此，用獨特序列數(shù)量決定的文庫規(guī)模要比用傳統(tǒng)方法計算的噬菌體展示庫多樣性（通過計算文庫轉(zhuǎn)化后的菌落數(shù)量）低幾個數(shù)量級。為了增加庫容，不僅要在建庫時增加供體的數(shù)量，還要簡化基因始動物料的使用數(shù)量。

使用合成文庫時，研究人員可以完全控制輸入的序列，這意味著可以去掉已知的在噬菌體上表現(xiàn)不佳的種系。最終，使用合成技術(shù)可以減少克隆優(yōu)勢并且獲得更高的序列多樣性，一般包含＞95%的獨特序列。

雖然合成文庫能更好地用獨特的克隆填補噬菌體文庫的理論序列空間，但它們是否具有與天然文庫相同的結(jié)構(gòu)多樣性還不得而知。尤其是 CDR-H3 環(huán)，它是最復(fù)雜的且對抗原特異性起最主要的決定作用 ，一般在合成文庫中被固定為窄環(huán)長度，這對某些靶點來說可能是個不利因素。因此，合成文庫理論上更大的規(guī)模可能無法轉(zhuǎn)化為比從純天然文庫中獲得的抗體更多樣化的功能。

3、專用抗體噬菌體文庫

為噬菌體展示篩選活動選擇合適的文庫是發(fā)現(xiàn)最佳抗體結(jié)合體的最關(guān)鍵步驟之一。影響文庫選擇的因素包括最終產(chǎn)品的應(yīng)用、抗原的性質(zhì)以及實驗室中文庫的可用性。新分子方法的出現(xiàn)使實驗室能夠構(gòu)建自己的抗體噬菌體庫組合，以復(fù)制免疫系統(tǒng)提供的天然抗體譜系。這些文庫中的許多都是根據(jù)早期藥物發(fā)現(xiàn)的需要設(shè)計的，具有結(jié)構(gòu)和序列多樣性。然而，有些應(yīng)用需要由具有特定結(jié)構(gòu)或序列特征的抗體組成的文庫。

（1）雙特異性抗體庫

標(biāo)準(zhǔn)人類抗體的兩個結(jié)合位點針對相同的表位，而與其相比，雙特異性抗體（bsAbs）的兩個結(jié)合位點針對不同的表位。這兩個結(jié)合位點可以針對相同的抗原（雙抗原決定簇 bsAbs），也可以針對兩種不同的抗原。在后者中，一個抗原決定簇可用于靶向特定區(qū)域或細(xì)胞，而另一個抗原決定簇則可與感興趣的抗原結(jié)合。bsAb 的典型應(yīng)用是癌癥免疫療法中的 T 細(xì)胞重定向（即重定向效應(yīng) T 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，以特異性消除腫瘤細(xì)胞），但癌癥以外的其他疾病領(lǐng)域也在探索之中，如炎癥性疾病、糖尿病、病毒和細(xì)菌感染以及阿爾茨海默病。

存在大量不同的雙特異性抗體形式，包括雙特異性 IgG（bsIgGs），異源雙價 VHH 二聚體結(jié)構(gòu)和 BiTEs。然而，其中一些抗體形式的制造并不簡單，例如 bsIgGs，在單個宿主細(xì)胞中生產(chǎn)，因為兩種不同抗體的重鏈和輕鏈共同表達(dá)會導(dǎo)致鏈的隨機配對和 IgG 分子的復(fù)雜混合物。最終，這種方法降低了相關(guān) bsIgG 的總體產(chǎn)量，而且副產(chǎn)品（包括錯誤配對鏈的 IgGs）中 bsIgG 的濃度相對較低，因此需要復(fù)雜的純化技術(shù)。為了簡化表達(dá)和純化步驟，開發(fā)了許多鏈配對的方法，包括共同輕鏈或重鏈?zhǔn)删�體展示文庫。這種方法允許在同一細(xì)胞中同時表達(dá)三條不同的鏈（而不是四條），得到的混合物只包含兩種單克隆抗體（mAbs）和一種 bsAb（而不是十種不同的分子）（圖 7a-c）。此外，具有共同輕鏈或重鏈的文庫還可用于發(fā)現(xiàn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域可用作創(chuàng)建新抗體形式的構(gòu)件。

（2）輕鏈與共同重鏈配對

可以構(gòu)建由共同重鏈和輕鏈可變基因的不同譜系構(gòu)建的基于 ScFv 的噬菌體展示文庫并且將其用于篩選針對兩個不同抗原的抗體。之所以選擇固定 VH，是因為它具有有利于體外展示技術(shù)的特征，具有天然人源抗體譜系或固有的穩(wěn)定性。VL 序列可以從健康人或病人的循環(huán) B 細(xì)胞中分離出來，也可以利用先進(jìn)的誘變策略在體外產(chǎn)生多樣性。這樣就可以分離出具有不同靶標(biāo)特異性的候選抗體，它們具有相同的重鏈，但可以攜帶 κ 或 λ 輕鏈。根據(jù)其結(jié)構(gòu)，這樣的全人源 bsIgG 形式，可同時攜帶一條 κ 和一條 λ 輕鏈的被稱為 κλ-body。這些專門的文庫已經(jīng)成功開發(fā)出來，并被用于檢測幾種可溶性和細(xì)胞表面的人類抗原，從而發(fā)現(xiàn)了高親和力 IgGκ 和IgGλ。這證實了輕鏈足以驅(qū)動抗體的特異性，該文庫也可以發(fā)現(xiàn)用于構(gòu)建靶向多個抗原的功能性 bsIgG。

（3）鏈與共同輕鏈配對

最常見的鏈配對策略依賴于使用常見的輕鏈和不同的多樣化的重鏈。

最常見的鏈配對策略是使用共同的輕鏈和不同的多樣化重鏈。這利用了 CDR-H3 的高度多樣性，這將主導(dǎo)在多個案例中的結(jié)合相互作用。雖然第一個基于 scFv 的共同輕鏈?zhǔn)删�體展示文庫在 20 世紀(jì) 90 年代就已經(jīng)出現(xiàn)，但隨后將其用于雙特異性抗體的難度比共同重鏈配對輕鏈更為復(fù)雜。事實上，必須對 Fc 區(qū)域的重鏈進(jìn)行修飾，才能迫使兩條不同的重鏈異源二聚化（例如，"KiH "技術(shù)，使用相反的靜電荷，或在 IgG 的同源二聚體界面上嫁接異源二聚體界面）。雖然這種方法已經(jīng)成功的應(yīng)用于 scFv 和 Fab庫中，即從天然或免疫譜系中同時也從已有抗體中提取共同輕鏈。

最近，隨著富含組氨酸共用輕鏈的雙特異性抗體的產(chǎn)生，復(fù)雜性進(jìn)一步增加，這使得抗體能以 pH 依賴性的方式結(jié)合靶標(biāo)，下面將詳細(xì)介紹。

（4）以 CDR-H3 為重點的文庫

在抗體-抗原復(fù)合物中，免疫球蛋白重鏈和輕鏈的 CDR3 是參與抗原接觸的最重要區(qū)域。特別是 CDR-H3，展示出了最大的 CDR 多樣性，無論實在序列上還是在長度上，這種多樣性經(jīng)常足以驅(qū)動抗體的特異性。因此，只需關(guān)注 CDR-H3 殘基的多樣性，就能創(chuàng)建具有相對較大結(jié)構(gòu)多樣性的小型文庫。

研究人員已經(jīng)揭示了不同物種抗體間 CDR-H3 的結(jié)構(gòu)差異。例如，研究發(fā)現(xiàn)，雞精蛋白、駱駝類和牛類抗體的 CDR-H3 比人類抗體的更長，盡管人類也有長 CDR-H3 的例子。雞精蛋白類抗體包含一大部分與靈活性有關(guān)的小氨基酸，高親和力結(jié)合的雞精蛋白抗體通常半胱氨酸的含量增加，這樣可以構(gòu)建復(fù)雜的含二硫鍵結(jié)構(gòu)的長環(huán)。利用酵母展示技術(shù)或免疫后對抗原結(jié)合 B 細(xì)胞進(jìn)行分選和 NGS 研究，發(fā)現(xiàn)了含針對表皮生長因子受體（EGFR）和補體成分 C5 的 CDR-H3 的�？贵w。這說明利用噬菌體展示技術(shù)也有可能從牛抗體庫中發(fā)現(xiàn)長環(huán)結(jié)合體。在駝科動物中，VHHs 往往以突出的環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合到抗原表面的凹腔中，而在�？苿游镏�，超長的 CDR-H3 區(qū)域形成一個 "莖和突 "獨立折疊的小結(jié)構(gòu)域，類似于結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域，它從抗體表面突出很遠(yuǎn)，在序列和二硫化物模式上都多種多樣。這種 "迷你折疊 "都有通用的形狀和尺寸，與多個小型二硫鍵蛋白家族相似，包括蛋白酶抑制劑、離子通道阻斷劑、蛇毒毒素和 G 蛋白偶聯(lián)受體配體。因此，與傳統(tǒng)抗體相比，這些非典型的抗原決定簇能提供與不同表位相互作用的能力，特別是存在于許多酶、孔、通道上的凹陷表面。作為概念驗證，最近開發(fā)了一種抗體形式---"結(jié)抗體"（KnotBodies），它類似于特殊的�？贵w，顯示結(jié)蛋白結(jié)構(gòu)域以代替 CDR2 環(huán)。這些結(jié)蛋白本身很難進(jìn)行工程化，在體內(nèi)的半衰期也很短，而抗體骨架可提高穩(wěn)定性并延長半衰期。結(jié)蛋白和抗體環(huán)序列都可以進(jìn)行工程化并用于噬菌體展示選擇，以優(yōu)化結(jié)合選擇性，例如抗體對離子通道的阻斷效力。

總之，對其他物種抗體的其他結(jié)構(gòu)特征的闡明揭示了可用于結(jié)合新型難靶表位的偏好，具有這些特征的新的專門噬菌體展示文庫正在出現(xiàn)。

（5） 側(cè)-環(huán)文庫

SdAbs 和抗體通過他們的 CDR 環(huán)模擬典型的結(jié)合抗原裂隙。因此，當(dāng)抗原表位不同（即相當(dāng)凸出）時，具有凸?fàn)羁乖瓫Q定簇的 sdAb 就不太可能與之結(jié)合。因此，研究人員通過將氨基酸多樣性的位置調(diào)整到常規(guī)環(huán)位置以外的殘基上，就能在單個免疫球蛋白樣支架上生成了一種新的識別表面。

Koide 等人觀察到，F(xiàn)N3 單體（從人纖連蛋白第 10 個 FN3 結(jié)構(gòu)域的多樣化文庫中篩選出的抗體類似物）通過最長的環(huán)和 β-sheet 面形成結(jié)合表面。根據(jù)上述觀察，構(gòu)建了單體“側(cè)面-環(huán)”文庫，在該文庫中最長的環(huán)和其臨近的 β-折疊攜帶多樣性。這相當(dāng)于免疫球蛋白的 CDR3 環(huán)和 β-sheet，它們介導(dǎo)重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的異源二聚化。使用 "側(cè)-環(huán) "和 "僅環(huán) "文庫進(jìn)行了幾輪噬菌體和酵母展示篩選后，結(jié)果表明這兩個文庫對不同靶標(biāo)的作用不同。事實上，對于一個靶標(biāo)（GFP），側(cè)庫克隆比環(huán)庫克隆具有更高的親和力，而對于另一個靶標(biāo)（hSUMO1），趨勢則相反。這證明了設(shè)計主要集中在側(cè)-環(huán)表面的選擇性文庫與傳統(tǒng)的環(huán)庫策略相比，在識別不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的表位上效率更高。

（6）組氨酸豐富的文庫

如上所述，抗體與抗原相互作用的 pH 依賴性對亞細(xì)胞轉(zhuǎn)運動力學(xué)和抗體再循環(huán)有一定影響。文獻(xiàn)中有許多從現(xiàn)有抗體中提取的對 pH 敏感的有效工程化抗體的例子。原理相對簡單，依賴于結(jié)合界面中加入組氨酸殘基，這些殘基在 pH 值低于 6 時可電離。當(dāng)這些殘基在酸性內(nèi)體中質(zhì)子化時，靜電相互作用的改變會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而失去與抗原的結(jié)合。此外，參與抗原結(jié)合的可電離組氨酸殘基的總數(shù)也會影響 pH 敏感性的程度。

大多數(shù)具有 pH 敏感性結(jié)合的工程抗體都是單獨使用組氨酸掃描或從現(xiàn)有抗體中提取組合組氨酸掃描文庫，而從原始文庫中分離出 pH 依賴性抗體的嘗試卻寥寥無幾。第一個例子是利用富含組氨酸殘基的基于 scFv 的合成噬菌體展示文庫的優(yōu)勢來尋找人類趨化因子 CXCL10 的 pH 依賴性結(jié)合體。通過在 CDR-H3 中的 8-15 個氨基酸中改變 YAT 和 NHT 密碼子構(gòu)建了富含組氨酸的文庫。 然而，經(jīng)過三輪篩選后，最佳克隆的 pH 依賴性太低，于是又創(chuàng)建了在輕鏈和重鏈的所有 CDR 中富含組氨酸的新文庫。這些基于 scFv 的新文庫最終產(chǎn)生了重新格式化的 IgG 克隆，在 pH 值為 7.2 時親和力低至納摩爾，而在 pH 值為 6.0 時解離速度快 22 倍。最近的另一項研究中利用組氨酸豐富和 CDR3 多樣化的 VNAR 結(jié)構(gòu)域酵母展示文庫對 EpCAM 進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有一種 pH 依賴性結(jié)合體。

優(yōu)化構(gòu)象或序列篩選，而非抗體重新工程化（即 pH 依賴結(jié)合特性的始動篩選）事實上，可以理解的是，已經(jīng)存在的抗體并不總是適合轉(zhuǎn)化為 pH 依賴性抗體。然而，僅有的兩個從頭分離的 pH 敏感抗體的例子可能表明了這一過程的難度，包括需要為 pH 依賴性和親和力成熟構(gòu)建額外的子庫。此外，組氨酸介導(dǎo)的 pH 依賴性結(jié)合限制了合適表位的數(shù)量，因為它們需要帶正電或質(zhì)子貢獻(xiàn)殘基。換句話說，帶負(fù)電荷或質(zhì)子受體的表位理論上很難成為 pH 依賴性結(jié)合抗原的靶標(biāo)。

結(jié)論
在本篇綜述中，展示了利用噬菌體展示篩選發(fā)現(xiàn)抗體的 4 個可以變更的參數(shù)：抗體形式、抗原展示、篩選策略和噬菌體展示庫設(shè)計。本篇綜述中提供的信息可以單獨使用，也可以在設(shè)計抗體發(fā)現(xiàn)活動時聯(lián)合應(yīng)用，主要依賴于所得抗體的需求。

參考文獻(xiàn)
1、Drug Discovery Today d Volume 27, Number 8 d August 2022