使用Antha軟件平臺增強MANTIS®液體處理器的功能
為了最大限度地提高使用細胞系統(tǒng)生產(chǎn)的各種生物制劑的質(zhì)量和產(chǎn)量，研究人員需要一直優(yōu)化生長條件。這涉及操縱多種生長培養(yǎng)基和過程變量（因子）以確定它們?nèi)绾斡绊?/span>質(zhì)量目標產(chǎn)品概況 (QTPP)，并且生長條件優(yōu)化實驗傳統(tǒng)上都是使用單次單因子 (OFAT) 方法。

盡管OFAT被廣泛使用，但只有在所研究的變量因子不相互影響的情況下，OFAT 才真正有效。但在實際工作中，不相互影響的情況很少見。為了克服OFAT的局限性，作為一種更復雜方法的試驗設(shè)計法(DoE)走上臺前，研究者用它來并行研究多個因子并揭示這些因子是如何相互關(guān)聯(lián)的。然而，盡管 DoE 有很多地方優(yōu)于 OFAT ，但由于操作經(jīng)驗的缺乏和液體處理的復雜性以及速度和通量這些會立刻變化的多因子限制，它在生物技術(shù)行業(yè)的使用受到限制。

為了克服這些挑戰(zhàn)，我們將Synthace的Antha軟件平臺的實驗操作計劃和數(shù)據(jù)管理功能與FORMULATRIX的高速自動化MANTIS®液體處理器相結(jié)合。DoE不再是一項重大挑戰(zhàn)，研究人員現(xiàn)在可以有效地開展 DoE 活動。使用eGFP的生產(chǎn)作為一個生物產(chǎn)品的指標，經(jīng)實驗證明，一個有著12變量因子的 DoE 涉及1298次獨特的實驗運行和近10000 個液體處理步驟，可以在3周內(nèi)僅通過3次 DoE 迭代優(yōu)化生長條件，使eGFP得到 5 倍 增產(chǎn)。

DoE 使同時研究多個實驗變量成為可能
科學實驗傳統(tǒng)上依賴于OFAT方法，即除了正在研究的因子外，實驗裝置中的所有內(nèi)容都保持不變。這種方法的問題在于，按順序處理不同的實驗參數(shù)會阻礙研究人員看到它們之間的相互作用，這種相互作用通常發(fā)生在許多生物系統(tǒng)中。這可能導致為下游研究選擇次優(yōu)條件，并限制對所研究系統(tǒng)的科學洞察力。

DoE克服了OFAT 方法的局限性，能讓研究人員同時研究許多不同的實驗因子。這不僅增強了對所研究因子 如何在多個維度上相互作用并影響正在研究過程的理解，而且還增加了找到穩(wěn)健的最佳條件的可能性（見圖 1 ）。

盡管與 OFAT 相比，DoE 提供了卓越的洞察力，但它的實驗執(zhí)行通常不容易通過自動化實現(xiàn)。例如，一個典型的全因子實驗按 2n 指數(shù)擴展（其中 n 是要研究的因子的數(shù)量）。在擴展方面其他更高效的設(shè)計都可能面臨類似的挑戰(zhàn)，這意味著即使可以使用自動化液體處理器，DoE 執(zhí)行的實驗計劃也會迅速變得笨拙。

與 OFAT 實驗不同，DoE 從根本上說是一種優(yōu)化方法，它提供了對關(guān)鍵工藝參數(shù) (CPP) 及其對生物生產(chǎn)過程的關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 的影響的理解。DoE實驗的每個部分都能讓實驗者在他們對所研究系統(tǒng)的科學理解之上進行構(gòu)建。

通過使研究人員能夠通過使用 DoE 來利用更多的科學見解，旨在簡化 DoE 實施的解決方案正在科學界得到廣泛采用，因為它們?yōu)閷嶒炑芯刻峁┝烁�大的價值。

圖 1. 單次單因子法 (OFAT) 和試驗設(shè)計法(DoE) 的比較。 (A) OFAT 方法假設(shè)因子不相互作用并且最優(yōu)條件是正交的，從而得到次優(yōu)工藝條件。 (B) DoE 的統(tǒng)計框架考慮因子和正交性之間的相互作用，并更有效地探索實驗設(shè)計空間，增強對過程的理解并增加找到穩(wěn)健最佳條件的可能性。

將 MANTIS® 與 Antha 相結(jié)合可簡化 DoE

在最近的一個案例研究中，Synthace Ltd 的研究人員將他們的 Antha 軟件平臺與來自Formulatrix 的高速自動化 MANTIS 液體處理器相結(jié)合，以執(zhí)行復雜的多因子 (DoE) 培養(yǎng)基優(yōu)化。本研究之所以選擇使用 MANTIS 是因為其體積小——能夠輕松裝入生物安全柜——以及其大容量移液體積范圍以及與篩選大量不同培養(yǎng)基組合所需的高容量 96 深孔板的先天兼容性。

使用 eGFP 的生產(chǎn)作為一個生物產(chǎn)品的指標，在 3 次 DoE 迭代中選擇了 12 個因子進行研究：

• 胰蛋白胨 (2–12 g/L)

• 酵母提取物 (5–25 g/L)

• 葡萄糖 (0, 5 g/L)

• 甘油 (0, 0.65% v/v) 

• MgSO4 (0.2, 0.3 g/L)

• 氯化鈉 (0, 5 g/L)

• 鼠李糖 (0.5, 3.0 mM)

• 生長溫度 (25, 37°C) 

• 搖動速度 (80, 1000 rpm) 

• 接種量 (15, 30 μL) 

• 復制起點 (pBR322, pUC) 

• 收獲時間 (8, 24 hours)

研究人員通過使用統(tǒng)計軟件生成 DoE 設(shè)計文件開始研究，這些文件是精心構(gòu)建的運行和條件列表，其中包含中心點、復制和對照以滿足統(tǒng)計要求 。接下來，將設(shè)計文件上傳到 Antha，其中還包含 DoE 自動化工作流程。該工作流程模擬了所有單獨的液體處理步驟，因此降低了此類復雜實驗的物理操作風險，如圖2所示。在此之后，Antha 對 MANTIS 進行了編程，以執(zhí)行 DoE 活動的第一次迭代的液體處理步驟。

圖 2. Antha 中液體處理步驟的可視化模擬。在初始篩選 DoE 中，使用了 825 個液體處理步驟來設(shè)置 96 個深孔板之一。左側(cè)的“板”是 MANTIS® 試劑架的抽象表示。在右側(cè)，可以在模擬中的任何點選擇任何孔，以檢查工作流程中添加的液體。

總的來說，此處描述的 DoE 實驗需要在 3 次 DoE 迭代中執(zhí)行 1,298 次獨特的實驗運行：11 個因子用于初始篩選，4 個因子具有精細水平，3 個因子用于驗證優(yōu)化的介質(zhì)和工藝條件。這分別相當于設(shè)置 13 個單獨的 96 深孔板所需的 6660、1414 和 1717 個液體處理步驟。

Antha 控制了所有規(guī)劃步驟，通過實驗設(shè)置示意圖引導用戶選擇所需的庫存濃度、體積和實驗室器具（參見圖2）。同時，MANTIS 在及時執(zhí)行實驗方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，僅使用11個芯片即可分配研究中涉及的全部液體試劑。統(tǒng)計軟件與兩個平臺的集成提供了一個迭代設(shè)計/測試/分析循環(huán)，以極大地簡化數(shù)據(jù)分析和模型改進，如圖3所示。

圖 3. 迭代、自動化 DoE 的通用過程。 (A) Antha 軟件平臺將來自統(tǒng)計軟件 (JMP®) 的輸入轉(zhuǎn)換為 MANTIS® 的液體處理說明文件。 Antha 然后匯集來自酶標儀的終點時間過程數(shù)據(jù)，并執(zhí)行一套預處理步驟來清理數(shù)據(jù)集以進行即時分析，包括重復分組、空白校正、相對熒光單位 (RFU) 和光學映射 密度 (OD) 數(shù)據(jù)和基本統(tǒng)計數(shù)據(jù)，例如平均值、標準差和 CV。 (B) 更詳細地說，包括 0 、2、 、6、8 和 24 小時的過程讀數(shù)、空白、對照和細胞密度讀數(shù)的 100 多個單獨的讀板機數(shù)據(jù)文件與 Antha 的執(zhí)行運行信息相匹配，以生成 以流線型和自動化的方式校正細胞密度和相對熒光信號。

在短短 3 周內(nèi)提高產(chǎn)量
使用 Antha 軟件平臺和 MANTIS 液體處理器聯(lián)合執(zhí)行復雜的多因子培養(yǎng)基優(yōu)化，研究人員證明，在 3 周內(nèi)僅執(zhí)行 3 次 DoE 迭代，eGFP 產(chǎn)量就比對照增加了 5 倍（見圖 4）。這一成功的基礎(chǔ)是兩個平臺的易使用、具有成本效益和集成設(shè)置，可以快速確定影響生物指標 eGFP 生產(chǎn)的因子。

圖4. 優(yōu)化 12 種生長培養(yǎng)基因子，使 eGFP 產(chǎn)量在 3 周內(nèi)平均增加 5 倍。定制篩選設(shè)計用于生成第一次迭代(DoE 1) 中 11 個因子對 eGFP 生產(chǎn)的貢獻的統(tǒng)計概況。從 DoE 1 中確定了促成最高 eGFP 產(chǎn)量的關(guān)鍵因子，然后在第二次迭代 (DoE 2) 中進行了調(diào)整：酵母提取物和鼠李糖的接種量和濃度。 DoE 2 中的收獲時間也有所不同，以探索更具經(jīng)濟效益的 8 小時培養(yǎng)是否足夠。所有其他因子保持不變。 DoE 2 具有使總 eGFP 產(chǎn)量平均比 LB 生長培養(yǎng)基對照增加 2 倍的效果。第三次也是最后一次迭代 (DoE 3) 側(cè)重于關(guān)鍵工藝參數(shù)：鼠李糖和葡萄糖的濃度以及多個收獲點的搖動速度�？傮w而言，結(jié)果表明，與 LB 對照相比，eGFP 產(chǎn)量增加了 5 倍。

與其他 DoE 方法相比可節(jié)省大量時間
除了將 eGFP產(chǎn)量提高 5 倍之外，將 Antha 軟件平臺與 MANTIS 液體處理器一起使用還可以顯著節(jié)省時間。與其他方法相比，例如將 Antha 與另一個移液機器人一起使用或在沒有 Antha 的情況下使用 MANTIS 液體處理器，將 Antha 與 MANTIS 液體處理器組合使用以計劃、執(zhí)行和匯總3次 DoE 迭代的數(shù)據(jù)可節(jié)省74%的時間。（參見圖 5）。因此，用戶可以更專注于設(shè)計和對實驗進行說明。

圖5.與其他方法相比，Antha和MANTIS®可節(jié)省時間。將MANTIS®液體處理器和Antha軟件平臺結(jié)合起來，計劃、執(zhí)行和匯總3次DoE迭代的數(shù)據(jù)，與在使用Antha的前提下使用另一臺液體處理器的或在不使用Antha的前提下使用MANTIS®相比，在96個深孔板中進行96次運行篩選DoE，可節(jié)省高達74%的時間。（預計時間基于Antha的人工實施和模擬的內(nèi)部經(jīng)驗）。

總結(jié)
DoE在生物過程優(yōu)化領(lǐng)域獲得了廣泛的關(guān)注，與OFAT方法相比具有明顯的優(yōu)勢。然而，DoE的實施帶來了一些挑戰(zhàn)，我們認為通過結(jié)合Antha軟件平臺和MANTIS液體處理器可以顯著減少這些挑戰(zhàn)，如本研究所示。這種組合簡化了DoE計劃和執(zhí)行，從根本上減少了所有流程優(yōu)化組中DoE實施的障礙�，F(xiàn)在，結(jié)合使用Antha和MANTIS簡化DoE的計劃和執(zhí)行，減少了這些障礙。 

通過調(diào)整本案例研究中描述的通用過程，從事生物制劑發(fā)現(xiàn)和上游過程開發(fā)的科學家可以使用DoE統(tǒng)計框架對其過程進行更科學的理解：錯誤更少，數(shù)據(jù)處理更精簡，動手時間更少，以及更快地獲得科學論斷。