四、GC Clamp GC鉗

引物與目的位點的有效結(jié)合需要有穩(wěn)定的5 末端。這一段有較強穩(wěn)定性的5 末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩(wěn)定結(jié)合。選擇有合適穩(wěn)定性的引物能在確保不產(chǎn)生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。

五、Secondary Structures二級結(jié)構(gòu)

二級結(jié)構(gòu)是引物設(shè)計中必須考慮的一個重要因素。二級結(jié)構(gòu)能顯著影響反應(yīng)中能與模板正確結(jié)合的引物數(shù)量，發(fā)卡結(jié)構(gòu)的存在能限制引物與目的位點的結(jié)合能力，從而降低擴增效率，形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴增中發(fā)揮作用。

六、Hairpin發(fā)卡結(jié)構(gòu)

發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是由于引物自身的互補堿基分子內(nèi)配對造成引物折疊形成的二級結(jié)構(gòu)，并由于發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成是分子內(nèi)的反應(yīng),僅僅需要三個連續(xù)堿基配對就可以形成。發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定從而不會干擾反應(yīng)，如果自由能值小于0 則該結(jié)構(gòu)可以干擾反應(yīng)。

七、Dimer 二聚體

引物之間的配對區(qū)域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結(jié)構(gòu)。它造成引物二聚體擴增并減少目的擴增產(chǎn)物，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴重，3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增。

八、False Priming 錯配

如果引物可以結(jié)合除目的位點外的其他區(qū)域，擴增效率將明顯降低目的產(chǎn)物帶將減少或出現(xiàn)涂布（smear）。3 末端連續(xù)幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對，在使用引物設(shè)計軟件時，您可以分別設(shè)定確認為錯配的3 末端或引物全長形成連續(xù)堿基配對的數(shù)量。

九、自由能問題（如何根據(jù)自由能判斷引物質(zhì)量）

1、ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度。一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（ΔG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯誤引發(fā)。3′末端雙鏈的ΔG是0～－2 kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時只有40%、到－8時少于20%、而－10時接近于0。

2、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR 正常反應(yīng)不能進行，與二聚體相關(guān)的一個參數(shù)是堿基的分布，3’端的連續(xù)GGG 或CCC 會導(dǎo)致錯誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3 kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結(jié)果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對反應(yīng)就沒有多大的影響了。

十、產(chǎn)物需要測序的PCR引物的設(shè)計問題

在DNA測序的PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)。這就是基于引物內(nèi)部穩(wěn)定性的經(jīng)驗之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應(yīng)中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應(yīng)，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末端與靶序列任何位點的牢固配合就可以引發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生非專一產(chǎn)物。無論如何，寡核苷酸3′末端最后5個核苷酸的穩(wěn)定性小于－9 kcal/mol的，通常就是專一性的探針或引物。寡核苷酸3′末端越不穩(wěn)定，假引發(fā)的可能性越低。

順便說一下，如果新手剛開始接觸引物設(shè)計，推薦使用Primer Premier 5.0，因為它界面簡單，易學(xué)易用；如果你想把引物設(shè)計得盡善盡美，公認的首選軟件是Oligo，其次我認為是DNAstar。Oligo功能強大，所以使用起來就沒有Primer Premier 5.0那么簡便。先用Primer Premier 5.0設(shè)計，然后把設(shè)計好的引物拿到Oligo里去檢測這對引物的優(yōu)劣，我想這對大多數(shù)引物設(shè)計者是一個不錯的選擇!