本文原創(chuàng)：張慶峰 本文來源：愛迪爾筆記

嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR T）療法屬于過繼性T細(xì)胞療法，其概念源于20世紀(jì)80年代，最初由以色列科學(xué)家Eshhar等人提出，通過將抗體的抗原識別域與T細(xì)胞受體結(jié)合，使T細(xì)胞能夠特異性識別并攻擊腫瘤細(xì)胞。

經(jīng)過幾代技術(shù)的迭代，CAR T細(xì)胞不斷優(yōu)化，從單一信號到多信號共刺激，再到分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)功能，如今已成為治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的重要手段，并在實(shí)體瘤治療中展現(xiàn)出巨大潛力。

1.1 什么是Adoptive T-cell therapy（過繼性T細(xì)胞療法）？
過繼性T細(xì)胞療法（Adoptive T-cell therapy, ACT）是一種利用患者自身T細(xì)胞來治療惡性腫瘤的細(xì)胞免疫療法。ACT的核心是將患者體內(nèi)的T細(xì)胞分離出來，在體外進(jìn)行擴(kuò)增、基因改造或激活，以增強(qiáng)其抗腫瘤能力，然后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。ACT主要包括以下幾種方法：

1. 腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TILs）：從腫瘤組織中分離出的T細(xì)胞，經(jīng)過體外擴(kuò)增后回輸。
2. 嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR T細(xì)胞）：通過基因工程技術(shù)將CAR導(dǎo)入T細(xì)胞，使其能夠特異性識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原。
3. 轉(zhuǎn)基因腫瘤特異性T細(xì)胞受體T細(xì)胞（TCR T細(xì)胞）：通過基因改造使T細(xì)胞表達(dá)特異性識別腫瘤抗原的TCR。

1.2 Principles of CAR T cells（CAR T細(xì)胞的原理）
1.2.1 Structure（結(jié)構(gòu)）
嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）是一種通過基因工程技術(shù)將不同受體的結(jié)構(gòu)域組合而成的人工受體。CAR的結(jié)構(gòu)主要包括以下幾個部分：

• 細(xì)胞外抗原識別域：通常來源于單克隆抗體的單鏈可變片段（scFv），能夠以非MHC限制性的方式識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原。這種非限制性識別方式是CAR T細(xì)胞的一大優(yōu)勢，因?yàn)樵S多腫瘤細(xì)胞會下調(diào)MHC I類分子的表達(dá)以逃避免疫監(jiān)視。
• 鉸鏈區(qū)：連接抗原識別域和跨膜域，為CAR的表達(dá)和抗原結(jié)合功能提供靈活性。鉸鏈區(qū)的長度會影響免疫突觸的形成，進(jìn)而影響CAR T細(xì)胞的功能。
• 跨膜區(qū)：將CAR錨定在細(xì)胞膜上，其序列通常來源于CD4、CD8或CD28等分子。跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)會影響CAR的二聚化，從而可能影響其信號傳導(dǎo)。
• 細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)：包含CD3ζ鏈和共刺激信號域（如CD28、4-1BB等）。CD3ζ鏈含有三個免疫受體酪氨酸基激活基序（ITAMs），在被磷酸化后能夠招募激酶并啟動TCR信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。共刺激信號域則通過PI3K/Akt、MAPK等信號通路影響T細(xì)胞的激活、細(xì)胞毒性、增殖、持久性、代謝活性和細(xì)胞因子分泌等功能。

1.2.2 CAR signaling（CAR信號傳導(dǎo)）
CAR T細(xì)胞的激活機(jī)制類似于TCR信號傳導(dǎo)。當(dāng)CAR的抗原識別域與靶抗原結(jié)合時，CAR會發(fā)生多聚化并模擬TCR信號傳導(dǎo)。CD3ζ鏈上的ITAMs被Src家族激酶LCK磷酸化后，招募ZAP70等下游信號分子，進(jìn)而激活LAT、PLC-γ等信號通路，最終導(dǎo)致NFκB、AP-1和NFAT等轉(zhuǎn)錄因子的激活。與TCR信號傳導(dǎo)不同的是，CAR信號傳導(dǎo)中CD28和4-1BB等共刺激信號域的激活方式也存在差異。CD28信號域的激活依賴于LCK，而4-1BB信號域則與LCK的結(jié)合較弱。這種差異導(dǎo)致了兩種CAR T細(xì)胞在早期激活信號強(qiáng)度、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞毒性功能和持久性等方面的不同表現(xiàn)。

1.2.3 Mechanism of action（作用機(jī)制）
CAR T細(xì)胞通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用：

• 直接細(xì)胞毒性：CAR T細(xì)胞識別并結(jié)合靶細(xì)胞后，通過釋放穿孔素和顆粒酶（如顆粒酶B）誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。此外，CAR T細(xì)胞還可以通過Fas-FasL軸介導(dǎo)靶細(xì)胞死亡。
• 細(xì)胞因子分泌：CAR T細(xì)胞激活后會分泌多種細(xì)胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6等。這些細(xì)胞因子不僅能夠增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性，還可以激活和招募其他免疫細(xì)胞（如NK細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）參與抗腫瘤反應(yīng)。然而，細(xì)胞因子的大量分泌也可能導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）等嚴(yán)重的不良反應(yīng)。
• 間接抗腫瘤作用：CD4+ CAR T細(xì)胞通過分泌IFN-γ等細(xì)胞因子激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬功能，并上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的MHC I類分子表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對免疫系統(tǒng)的敏感性。此外，IFN-γ還可以通過上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面的Fas受體表達(dá)，增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的Fas-FasL介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用。

1.3 Evolution of CAR T cells（CAR T細(xì)胞的演變）
1.3.1 First generation（第一代）
第一代CAR的設(shè)計靈感來源于將抗體的抗原識別功能與TCR的信號傳導(dǎo)功能相結(jié)合。其細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)僅包含CD3ζ鏈，這種設(shè)計的CAR T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中顯示出一定的抗腫瘤活性，但由于其增殖能力、細(xì)胞毒性功能和持久性有限，治療效果并不理想。

1.3.2 Second generation（第二代）
為了增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的功能，第二代CAR在第一代的基礎(chǔ)上增加了共刺激信號域（如CD28或4-1BB）。這種設(shè)計顯著提高了CAR T細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞因子分泌和持久性。與CD28信號域相比，4-1BB信號域的CAR T細(xì)胞在體內(nèi)具有更長的持久性和更低的激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（AICD）風(fēng)險，但CD28信號域的CAR T細(xì)胞在早期細(xì)胞毒性功能上更強(qiáng)。目前，所有已獲FDA批準(zhǔn)的CAR T細(xì)胞產(chǎn)品均采用第二代CAR設(shè)計。

1.3.3 Third generation（第三代）
第三代CAR進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)增加了第二個共刺激信號域（如CD28和4-1BB或OX40等）。這種設(shè)計旨在進(jìn)一步增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的激活、增殖和持久性。然而，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，第三代CAR T細(xì)胞與第二代相比在療效和安全性上并無顯著差異，因此其優(yōu)勢仍有待進(jìn)一步研究。

1.3.4 Fourth generation（第四代）
第四代CAR T細(xì)胞被稱為“TRUCKs”（T細(xì)胞重定向用于抗原非限制性細(xì)胞因子介導(dǎo)殺傷的T細(xì)胞），其特點(diǎn)是CAR T細(xì)胞被設(shè)計為能夠分泌細(xì)胞因子（如IL-12、IL-18、IL-15、IL-7、IL-21等）。這種設(shè)計的目的是增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的抗腫瘤功能，并通過細(xì)胞因子招募旁觀者T細(xì)胞參與抗腫瘤反應(yīng)，從而克服實(shí)體瘤中CAR T細(xì)胞療效不佳的問題。此外，針對腫瘤微環(huán)境的策略也被納入第四代CAR的設(shè)計中，例如通過表達(dá)逆轉(zhuǎn)信號受體（如IL-4R/IL-7R）或分泌抗體來中和免疫抑制因子（如TGF-β）。

IL-12 TRUCKs

• 性能變化：IL-12是一種強(qiáng)效的促炎細(xì)胞因子，能夠顯著增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的抗腫瘤活性。它通過激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞，增強(qiáng)IFN-γ的分泌，從而提高細(xì)胞毒性功能（Ferlazzo et al., 2004; Kubin et al., 1994）。此外，IL-12可以阻斷Tregs的擴(kuò)增，減少免疫抑制（X. Cao et al., 2009）。
• 表型變化：IL-12分泌的CAR T細(xì)胞傾向于分化為Th1表型，表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和抗腫瘤能力（Manetti et al., 1993）。然而，IL-12的全身應(yīng)用可能導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性，如肝毒性、肺毒性等（Car et al., 1999）。因此，通過CAR T細(xì)胞在腫瘤局部分泌IL-12，可以在減少系統(tǒng)性毒性的同時增強(qiáng)抗腫瘤效果（Chmielewski & Abken, 2015）。

IL-18 TRUCKs

• 性能變化：IL-18是一種多效性細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖和IFN-γ分泌（Yasuda et al., 2019）。在小鼠模型中，IL-18分泌的CAR T細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性，尤其是對大型實(shí)體瘤（Chmielewski & Abken, 2017）。
• 表型變化：IL-18能夠推動T細(xì)胞向T-bet高表達(dá)、FoxO1低表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞表型分化，同時減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞和Tregs的數(shù)量，增加M1型巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例（Chmielewski & Abken, 2017）。這種表型變化有助于增強(qiáng)CAR T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的浸潤和抗腫瘤效果。

IL-15 TRUCKs

• 性能變化：IL-15能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性功能，同時通過提高granzyme B的表達(dá)來維持T細(xì)胞的活性（Tamang et al., 2006）。在小鼠模型中，IL-15分泌的CAR T細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更長的持久性（Hoyos et al., 2010）。
• 表型變化：IL-15分泌的CAR T細(xì)胞傾向于維持早期記憶細(xì)胞（TSCM）和中央記憶細(xì)胞（TCM）的表型，這些細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和更長的存活時間（Hoyos et al., 2010）。此外，IL-15還能夠減少PD-1等抑制性受體的表達(dá)，從而增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的抗腫瘤功能。

IL-7 TRUCKs

• 性能變化：IL-7是一種重要的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和存活，同時具有抗凋亡作用（MacKall et al., 2011）。IL-7分泌的CAR T細(xì)胞在體內(nèi)外均顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更長的持久性（L. Li et al., 2012）。
• 表型變化：IL-7能夠維持T細(xì)胞的早期分化狀態(tài)，減少終末分化效應(yīng)細(xì)胞的比例（Schluns et al., 2000）。這種表型變化有助于CAR T細(xì)胞在體內(nèi)長期存活并持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用。

IL-21 TRUCKs

• 性能變化：IL-21是一種多效性細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖、存活和細(xì)胞毒性功能，同時維持早期記憶細(xì)胞的表型（Hinrichs et al., 2008）。在小鼠模型中，IL-21分泌的CAR T細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更長的持久性（Štach et al., 2020）。
• 表型變化：IL-21能夠維持T細(xì)胞的早期記憶細(xì)胞（TSCM）和中央記憶細(xì)胞（TCM）的表型，減少終末分化效應(yīng)細(xì)胞的比例（Hinrichs et al., 2008）。此外，IL-21還能夠抑制Tregs的擴(kuò)增，減少免疫抑制（Attridge et al., 2012）。這種表型變化有助于CAR T細(xì)胞在體內(nèi)長期存活并持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤作用。

IL-10 TRUCKs

• 性能變化：IL-10是一種具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的代謝適應(yīng)性和抗腫瘤功能（Fujii et al., 2001）。在小鼠模型中，IL-10分泌的CAR T細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性和更長的持久性（Y. Zhao et al., 2024）。
• 表型變化：IL-10能夠促進(jìn)T細(xì)胞向早期記憶細(xì)胞（TSCM）表型分化，增強(qiáng)其代謝適應(yīng)性和抗腫瘤功能（Y. Zhao et al., 2024）。此外，IL-10還能夠減少免疫抑制細(xì)胞（如Tregs和MDSCs）的數(shù)量，從而增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的抗腫瘤效果。

1.3.5 Fifth-generation, next-generation（第五代及下一代）
第五代CAR T細(xì)胞的設(shè)計更加復(fù)雜，引入了邏輯門控（如“OR”、“AND”、“NOT”等）的概念，以實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的靶向和更高的安全性。這些設(shè)計利用合成生物學(xué)和邏輯門控技術(shù)，使CAR T細(xì)胞能夠根據(jù)特定的邏輯條件進(jìn)行激活或抑制。以下是邏輯門控的具體設(shè)計和實(shí)現(xiàn)：

1.3.5.1 “OR-gate”（或門）
“OR-gate”設(shè)計允許CAR T細(xì)胞在識別多個抗原中的任意一個時被激活。這種設(shè)計可以防止腫瘤細(xì)胞通過丟失或下調(diào)單一抗原來逃逸治療。具體實(shí)現(xiàn)方式包括：

• 雙靶向：通過共表達(dá)兩個CAR分子，每個CAR識別不同的抗原。例如，Ruella等（2016）通過共表達(dá)針對CD19和CD20的CAR，顯著提高了CAR T細(xì)胞的抗腫瘤效果。
• 串聯(lián)CAR（TanCAR）：將兩個scFv串聯(lián)在一起，形成一個雙特異性CAR。這種設(shè)計允許CAR T細(xì)胞在識別任意一個抗原時被激活，并且在識別兩個抗原時表現(xiàn)出更強(qiáng)的信號傳導(dǎo)（Grada等，2013）。
• 環(huán)狀串聯(lián)CAR：將scFv以環(huán)狀結(jié)構(gòu)排列，進(jìn)一步優(yōu)化了雙特異性CAR的設(shè)計（Z. Chen等，2023）。

1.3.5.2 “AND-gate”（與門）
“AND-gate”設(shè)計要求CAR T細(xì)胞只有在同時識別多個特定抗原時才會被激活。這種設(shè)計可以減少非靶向組織的毒性，提高治療的安全性。具體實(shí)現(xiàn)方式包括：

• 組合信號：通過設(shè)計兩個CAR分子，每個CAR提供一個信號，只有當(dāng)兩個信號同時存在時，CAR T細(xì)胞才會被完全激活（Kloss等，2013）。
• 合成Notch受體（synNotch）：通過synNotch系統(tǒng)，CAR T細(xì)胞在識別第一個抗原后，會誘導(dǎo)第二個CAR的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)“AND-gate”邏輯（Roybal等，2016）。例如，Choe等（2021）利用synNotch系統(tǒng)在治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的CAR T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了精確的靶向。
• 3-input AND-gate：Williams等（2020）開發(fā)了一種3-input AND-gate系統(tǒng)，通過級聯(lián)或并行設(shè)計，實(shí)現(xiàn)了更復(fù)雜的邏輯控制。在小鼠模型中，這種系統(tǒng)能夠精確識別三陽性腫瘤細(xì)胞，并表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤效果。

1.3.5.3 “NOT-gate”（非門）
“NOT-gate”設(shè)計允許CAR T細(xì)胞在識別非腫瘤抗原時被抑制，從而避免對正常組織的攻擊。具體實(shí)現(xiàn)方式包括：

• 抑制性CAR（iCAR）：通過將抑制性受體（如PD-1或CTLA-4）的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)替換為CAR T細(xì)胞的信號傳導(dǎo)區(qū)，實(shí)現(xiàn)對非腫瘤抗原的抑制（Fedorov等，2013）。例如，Aoyama等（2022）開發(fā)了一種“Scissor CAR”，通過識別健康細(xì)胞表面的抗原，抑制CAR T細(xì)胞的激活。
• OFF-Notch受體：通過設(shè)計OFF-Notch受體，當(dāng)識別到健康組織抗原時，會誘導(dǎo)表達(dá)凋亡因子，從而導(dǎo)致CAR T細(xì)胞的凋亡（Williams等，2020）。

1.3.5.4 Universal CARs（通用CAR）
通用CAR設(shè)計允許CAR T細(xì)胞通過適配器分子識別多種抗原，從而實(shí)現(xiàn)CAR T細(xì)胞的多功能性和通用性。這種設(shè)計可以降低治療成本并提高治療的靈活性。具體實(shí)現(xiàn)方式包括：

• Fc結(jié)合適配器CAR：通過設(shè)計CAR T細(xì)胞表達(dá)Fc受體，使其能夠結(jié)合抗體藥物，從而實(shí)現(xiàn)對多種抗原的識別（Kudo等，2014）。
• 標(biāo)簽特異性適配器CAR：通過設(shè)計CAR T細(xì)胞識別特定的標(biāo)簽分子（如生物素或FITC），并結(jié)合相應(yīng)的適配器分子，實(shí)現(xiàn)對多種抗原的識別（Lohmueller等，2018）。
• 雙特異性分子結(jié)合適配器CAR：通過設(shè)計CAR T細(xì)胞結(jié)合雙特異性抗體，實(shí)現(xiàn)對多種抗原的識別（Choi等，2019）。

1.3.5.5 CAR with JAK/STAT signaling（JAK/STAT信號通路CAR）
通過將細(xì)胞因子受體的信號傳導(dǎo)域整合到CAR中，CAR T細(xì)胞可以在沒有外源細(xì)胞因子的情況下持續(xù)激活。這種設(shè)計可以增強(qiáng)CAR T細(xì)胞的增殖和持久性（Kagoya等，2018）。

1.3.5.6 Suicide switches（自殺開關(guān)）
為了提高CAR T細(xì)胞治療的安全性，研究者們開發(fā)了自殺開關(guān)技術(shù)，通過引入可誘導(dǎo)的凋亡基因或代謝開關(guān)，可以在CAR T細(xì)胞引起嚴(yán)重不良反應(yīng)時將其清除。具體實(shí)現(xiàn)方式包括：

• 代謝開關(guān)：通過設(shè)計CAR T細(xì)胞表達(dá)代謝酶，使其在特定代謝物存在時發(fā)生凋亡（Berger等，2006）。
• 誘導(dǎo)性凋亡基因：通過設(shè)計CAR T細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)性凋亡基因（如iCasp9），在特定藥物存在時誘導(dǎo)CAR T細(xì)胞凋亡（Stasi等，2011）。
• 表面抗原靶向：通過設(shè)計CAR T細(xì)胞表達(dá)特定的表面抗原，使其能夠被抗體藥物靶向清除（Griffioen等，2009）。

CAR T細(xì)胞療法作為一種革命性的癌癥治療方法，已經(jīng)取得了顯著的臨床療效，尤其是在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中。然而，CAR T細(xì)胞在實(shí)體瘤治療中的應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如腫瘤微環(huán)境的免疫抑制、CAR T細(xì)胞的持久性和安全性等。隨著合成生物學(xué)和邏輯門控技術(shù)的發(fā)展，第五代及下一代CAR T細(xì)胞設(shè)計引入了邏輯門控的概念，通過“OR-gate”、“AND-gate”和“NOT-gate”等邏輯門控，實(shí)現(xiàn)了更精準(zhǔn)的靶向和更高的安全性。這些設(shè)計不僅提高了CAR T細(xì)胞的抗腫瘤效果，還減少了對正常組織的毒性。未來，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，CAR T細(xì)胞療法有望在更多類型的癌癥治療中發(fā)揮重要作用。