調節(jié)性T細胞是維持機體免疫穩(wěn)態(tài)的CD4+ T細胞亞群，也是腫瘤微環(huán)境中免疫抑制屏障的主要構成細胞。因此，特異性地調控腫瘤微環(huán)境的Treg細胞使其功能與穩(wěn)定性發(fā)生改變，將能夠促進腫瘤殺傷反應的發(fā)生。

2024年，上海交通大學醫(yī)學院上海市免疫學研究所李斌課題組及合作團隊在國際期刊Nature Communications在線發(fā)表了題為“FOXP3+ regulatory T cell perturbation mediated by the IFNγ-STAT1-IFITM3 feedback loop is essential for anti-tumor immunity”的研究論文。該研究首次提出了腫瘤浸潤Treg細胞中IFN-γ依賴的STAT1-IFITM3負反饋環(huán)路。此環(huán)路通過平衡STAT1與IFITM3的表達量進而維持腫瘤浸潤Treg細胞的免疫抑制功能，當該環(huán)路出現不平衡，則會引起Treg免疫抑制功能下降，促炎功能上升的功能擾動變化。
 

圖片來源：《Nature Communications》
（https://www.nature.com/articles/s41467-023-44391-9）

研究材料
在本研究中，研究人員構建了Treg條件性敲除Ifitm3和Treg特異性敲除Stat1的小鼠，以及兩者雙敲的小鼠。Ifitm3f/fFoxp3YFP-Cre小鼠（cKO），Stat1f/fFoxp3YFP-Cre小鼠（SKO)，Stat1f/fIfitm3f/fFoxp3YFP-Cre（DKO）（其中Ifitm3f/f小鼠與Stat1f/f小鼠由賽業(yè)生物提供）進行體內研究。

研究方法
本研究采用體內體外研究相結合，通過臨床腫瘤患者樣本分析，小鼠腫瘤模型構建，腫瘤微環(huán)境免疫細胞流式分析，結合RNA-seq，ChIP，免疫共沉淀等生化實驗，評估IFNγ-STAT1-IFITM3負反饋環(huán)路對Treg細胞功能與穩(wěn)定性所產生的調控作用。

技術路線
01 IFITM3缺失的Treg細胞會促進腫瘤殺傷反應
02 IFITM3結合JAK-STAT1復合體并抑制STAT1的磷酸化激活
03 IFITM3與STAT1形成相互調節(jié)的負反饋環(huán)路
04 IFNγ-STAT1-IFITM3負反饋環(huán)路調節(jié)腫瘤浸潤Treg細胞的免疫抑制功能

研究結果
1. IFITM3在Treg細胞中的缺失會增強腫瘤殺傷反應
研究人員在WT與cKO小鼠中構建了皮下MC38移植瘤型。結果顯示，與WT小鼠相比，cKO小鼠的皮下腫瘤體積明顯變�。▓D1 a），腫瘤重量也明顯小于WT小鼠（圖1 b），荷瘤小鼠的生存曲線也出現了同樣的變化趨勢（圖1 c）。

cKO小鼠的腫瘤內浸潤著更高比例的CD8+ T細胞與NK細胞（圖1 d,e）。此外，cKO小鼠腫瘤中浸潤的Teff細胞與CD8+ T細胞顯示出增殖更強的現象（圖1 f）。通過流式檢測Teff細胞與CD8+ T細胞分泌的抗腫瘤細胞因子IFN-γ與TNF-α，研究人員發(fā)現，cKO小鼠腫瘤中浸潤的殺傷性細胞確實分泌了更多的抗腫瘤細胞因子（圖1 g,h）。這說明cKO小鼠腫瘤生長受到抑制的直接原因是cKO小鼠的腫瘤內浸潤了更多比例且殺傷能力更強的腫瘤殺傷性細胞。
 

圖1 缺失IFITM3的Treg細胞促進腫瘤殺傷反應[1]

2. IFITM3結合JAK-STAT1復合體并抑制STAT1的磷酸化激活
IFITM3缺失的Treg細胞中，STAT1的蛋白水平顯著上升（圖2 a）。敲除IFTM3后，Treg細胞內STAT1的磷酸化（Tyr701）水平顯著上升（圖2 b,c）。同時，免疫熒光結果顯示，IFITM3缺失的Treg細胞內磷酸化STAT1水平上升，入核增加，且STAT1的蛋白量上升。提示IFITM3可能通過影響STAT1的磷酸化對STAT1的入核產生影響（圖2 d）。對WT與Ifitm3敲除的Treg細胞的ChIP-qPCR檢測結果顯示，Ifitm3敲除后，STAT1對其下游基因Ifi44與Psmb9的轉錄調節(jié)確實增強（圖2 e）。
 

圖2 IFITM3結合JAK-STAT1復合體并抑制STAT1的磷酸化激活[1]

3. IFITM3與STAT1形成相互調節(jié)的負反饋環(huán)路
STAT1與IFITM3都是能夠被IFN-γ細胞因子誘導表達的蛋白。STAT1能夠在細胞膜接受信號，進而進入細胞核介導其下游基因的轉錄。因此研究人員產生了一個猜測，STAT1是否也能夠調節(jié)IFITM3的表達呢？首先，研究人員發(fā)現誘導Th1反應的細胞因子，IFN-γ，IL-12與IL-27均能夠誘導IFITM3與STAT1的表達（圖3 a）。接下來，研究人員構建了STAT1條件性敲除的小鼠（其中Stat1f/f小鼠小鼠由賽業(yè)生物提供）。檢測結果顯示，STAT1缺失后，Treg細胞內的IFITM3蛋白表達量與轉錄水平顯著下降（圖3 b,c）。這說明STAT1能夠調節(jié)IFITM3的轉錄翻譯，且接下來，研究人員預測了STAT1在Ifitm3轉錄起始區(qū)域上的結合位點，并通過ChIP-qPCR實驗，檢測到STAT1能夠結合在Ifitm3的轉錄起始位點進而影響Ifitm3的轉錄翻譯過程（圖3 d）。
 

圖3 IFITM3與STAT1形成相互調節(jié)的負反饋環(huán)路[1]

4. IFNγ-STAT1-IFITM3負反饋環(huán)路調節(jié)腫瘤浸潤Treg細胞的免疫抑制功能
接下來，研究人員對WT小鼠，cKO小鼠，SKO小鼠與DKO小鼠（其中Ifitm3f/f小鼠與Stat1f/f小鼠由賽業(yè)生物提供）建立了MC38皮下移植瘤模型，在體內的腫瘤模型中評估STAT1-IFITM3負反饋環(huán)路的功能。結果顯示，cKO小鼠與SKO小鼠的腫瘤生長和腫瘤重量受到顯著抑制，而DKO小鼠的腫瘤生長趨勢則與WT小鼠十分接近（圖4 a,b）。腫瘤浸潤的Treg細胞比例以及Treg細胞，CD8+ T細胞，NK細胞的數目檢測結果也顯示，cKO小鼠與SKO小鼠的腫瘤中浸潤著更高比例的Treg細胞和腫瘤殺傷性細胞，可是DKO小鼠卻沒有發(fā)生此變化（圖4 c-f）。與此一致的是，cKO小鼠與SKO小鼠腫瘤浸潤的CD4+與CD8+殺傷性T細胞均分泌更高水平的IFN-γ，因此引起了更強的抗腫瘤免疫反應，可是DKO小鼠腫瘤浸潤的殺傷性T細胞分泌的IFN-γ水平與WT幾乎沒有差異，甚至可能更低（圖4 g,h）。
 

圖4 IFNγ-STAT1-IFITM3負反饋環(huán)路調節(jié)腫瘤浸潤Treg細胞的免疫抑制功能[1]

研究結論

圖5 STAT1-IFITM3反饋環(huán)路[1]

綜上，研究團隊提出，STAT1-IFITM3反饋環(huán)路可能是Treg特異性抗腫瘤療法的潛在靶點。阻斷STAT1或IFITM3的表達能夠破壞該環(huán)路的平衡，進而導致Treg出現功能不穩(wěn)定的促殺傷狀態(tài)。這為腫瘤浸潤Treg細胞功能與穩(wěn)定性的研究提供了新的理論依據，也為以Treg內信號環(huán)路作為靶點增強抗腫瘤免疫提供了新思路。

參考文獻：[1]Liu X, Zhang W, Han Y, et al. FOXP3+ regulatory T cell perturbation mediated by the IFNγ-STAT1-IFITM3 feedback loop is essential for anti-tumor immunity. Nat Commun. 2024;15(1):122. Published 2024 Jan 2. doi:10.1038/s41467-023-44391-9
 

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品系名稱：C57BL/6JCya-Stat1em1flox/Cya
產品編號：S-CKO-05336
應用方向：代謝,免疫,腫瘤等