膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）在基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳層面上表現(xiàn)出高度的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性。GBM與腫瘤免疫微環(huán)境之間的相互作用在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。然而，GBM如何促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境的機(jī)制仍然不清楚。英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)再生醫(yī)學(xué)中心的Steven M. Pollard團(tuán)隊(duì)^[1]通過(guò)體外試驗(yàn)和動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞（glioblastoma stem cell, GSC）通過(guò)表觀遺傳途徑進(jìn)行免疫編輯，促進(jìn)髓系細(xì)胞的招募，形成富含髓系細(xì)胞的腫瘤微環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

本文中細(xì)胞分選及細(xì)胞系的構(gòu)建均采用單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell。該系統(tǒng)可確保分選出的細(xì)胞100%為單細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化、高成活率的單克隆細(xì)胞系構(gòu)建、微生物分選與培養(yǎng)、單細(xì)胞分選、單細(xì)胞組學(xué)等功能。

單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell

 
研究者在BL6小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞中分別引入了五種已確定的GBM驅(qū)動(dòng)突變（包括EGFRvⅢ過(guò)表達(dá)、PDGFRA過(guò)表達(dá)、以及NF1、PTEN和TP53的基因敲除）（圖1A）。隨后，研究者將這些突變組合在一起以模擬GBM。他們通過(guò)同時(shí)敲除NF1和PTEN并過(guò)表達(dá)EGFRvIII，形成了帶有三重突變的NPE細(xì)胞系（圖1B-C）。在這種細(xì)胞系中，可以觀察到小鼠體內(nèi)出現(xiàn)侵襲性的腫瘤生長(zhǎng)和浸潤(rùn)（圖1D），以及GBM的典型特征（圖1E-H），可以用其來(lái)模擬腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）的相互作用。為了對(duì)照，研究者在免疫缺陷的NSG小鼠中平行生成了相應(yīng)的腫瘤（圖1I）。NPE腫瘤能夠誘發(fā)BL6小鼠的免疫反應(yīng)，在BL6小鼠中的生長(zhǎng)速度比在NSG小鼠中更慢（圖1J），而且大多數(shù)BL6宿主能夠在腫瘤檢測(cè)不到的情況下長(zhǎng)期生存（圖1G）。這些數(shù)據(jù)表明，BL6小鼠的宿主免疫系統(tǒng)對(duì)NPE細(xì)胞產(chǎn)生了反應(yīng)，并限制了腫瘤的生長(zhǎng)。

圖1 工程GSC在連續(xù)移植中獲得免疫逃逸能力
 

因此，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)移植后的原代培養(yǎng)，可以富集獲得免疫逃逸能力的細(xì)胞。研究者在進(jìn)行三輪BL6小鼠移植及其腫瘤原代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)NPE-IE細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的腫瘤形成能力（圖1I），并且小鼠的生存期顯著縮短（圖1J），這表明NPE-IE細(xì)胞獲得了免疫逃逸的能力。這與免疫編輯的概念相符，即宿主的持續(xù)免疫攻擊導(dǎo)致了具有更強(qiáng)免疫逃逸能力的細(xì)胞的出現(xiàn)。

為了揭示NPE-IE細(xì)胞獲得免疫逃逸能力的內(nèi)在機(jī)制，研究者將NPE細(xì)胞和NPE-IE細(xì)胞分別與野生型NSCs進(jìn)行了對(duì)比。然而，通過(guò)核型分析和全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示無(wú)論是倍性、結(jié)構(gòu)還是點(diǎn)突變都沒(méi)有顯著異常（圖2A），這表明NPE-IE腫瘤的獲得性免疫逃逸并非源于克隆進(jìn)化或經(jīng)典的遺傳免疫編輯過(guò)程。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Ccl9和Irf8的高表達(dá)可能與“訓(xùn)練”免疫逃逸有關(guān)（圖2B、2F）。既往研究已表明，Ccl9與致瘤性微環(huán)境的建立有關(guān)，這可以解釋NPE-IE腫瘤中髓系細(xì)胞的增加；而Irf8表達(dá)的上調(diào)則令人意外，因?yàn)樗�作為髓系特異性轉(zhuǎn)錄因子通常僅在造血細(xì)胞中表達(dá)，參與髓樣細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化。綜上所述，研究者發(fā)現(xiàn)機(jī)體對(duì)NPE細(xì)胞的免疫攻擊可以引發(fā)腫瘤顯著的轉(zhuǎn)錄改變。

圖2 免疫逃避細(xì)胞在免疫攻擊后進(jìn)行了顯著的轉(zhuǎn)錄重組
 

研究者還發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中許多基因的去甲基化與免疫逃逸有關(guān)（圖3D）。最顯著的甲基化變化出現(xiàn)在Irf8的啟動(dòng)子和編碼區(qū)，其低甲基化與轉(zhuǎn)錄活性的增加相一致（圖3D-E）。

圖3 NPE-IE細(xì)胞的免疫逃逸特性通過(guò)表觀遺傳免疫編輯而強(qiáng)化
 

巨噬細(xì)胞可以通過(guò)干擾素γ（IFNγ）誘導(dǎo)的STAT1信號(hào)通路來(lái)引發(fā)Irf8的表達(dá)。研究者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)自免疫腫瘤微環(huán)境的慢性IFNγ信號(hào)可能會(huì)刺激NPE細(xì)胞中Irf8的表達(dá)激活（圖4B-C），且這種激活與Irf8位點(diǎn)的DNA去甲基化狀態(tài)相一致。JAK/STAT抑制劑托法替尼未能逆轉(zhuǎn)NPE-IE細(xì)胞中IRF8的表達(dá)，這表明在NPE-IE細(xì)胞中，維持Irf8高表達(dá)的機(jī)制是不依賴于JAK/STAT的（圖4D）。

圖4 Irf8對(duì)IFNγ及TAM信號(hào)的應(yīng)答在免疫逃逸中有重要作用
 

經(jīng)過(guò)IFNγ處理后，NPE細(xì)胞中關(guān)鍵基因（如Irf8、H2-Ab1）出現(xiàn)了廣泛的激活（圖4E）。研究表明，浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞群（F4/80+，CD45hi）可能會(huì)刺激免疫原性NPE細(xì)胞發(fā)生上述轉(zhuǎn)錄變化（圖4F），這表明腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞可能是TME中IFNγ的主要來(lái)源。

研究者使用iotaSciences的單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)isoCell分選并培養(yǎng)了NPE-IE Irf8敲除細(xì)胞，隨后構(gòu)建了相應(yīng)的細(xì)胞系。NPE-IE Irf8敲除細(xì)胞系的腫瘤發(fā)展動(dòng)力學(xué)與移植了NPE-IE細(xì)胞的小鼠相似（圖4H-I），證明Irf8的激活是NPE-IE細(xì)胞免疫逃逸的重要因素，并且這種激活可能通過(guò)體內(nèi)的IFNγ信號(hào)介導(dǎo)。

文中使用的單細(xì)胞可視化分選培養(yǎng)系統(tǒng)—isoCell采用GRID技術(shù)，在培養(yǎng)皿上雕刻出單獨(dú)的細(xì)胞腔室陣列，并將單個(gè)細(xì)胞以納升體積全自動(dòng)地分配到各個(gè)GRID單細(xì)胞腔室中。isoCell自帶的成像系統(tǒng)，可確保分選出的細(xì)胞100%為單細(xì)胞。isoCell可以將單細(xì)胞在GRID中培養(yǎng)成單克隆細(xì)胞系，培養(yǎng)過(guò)程中可以根據(jù)客戶需求進(jìn)行換液操作，全流程可視化監(jiān)控以保證每個(gè)單克隆細(xì)胞系均來(lái)自所挑選的單個(gè)細(xì)胞。

這項(xiàng)研究揭示了GBM細(xì)胞在受到免疫攻擊后，通過(guò)表觀遺傳重組和髓系特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，增強(qiáng)TME的免疫抑制性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。這為監(jiān)測(cè)免疫治療過(guò)程中GBM細(xì)胞的免疫逃逸及制定新的免疫治療策略提供了新的思路，對(duì)于在GBM中發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳免疫編輯過(guò)程是否也適用于其他腦瘤或癌癥，將具有重要意義。

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參考文獻(xiàn)：

[1]. Gangoso,   E., Southgate, B., Bradley, L., Rus, S., Galvez-Cancino, F., McGivern, N.,   ... & Pollard, S. M. (2021). Glioblastomas acquire myeloid-affiliated   transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune   evasion. Cell, 184(9), 2454-2470.