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來自上海交通大學醫(yī)學院的Jiahui Du，Yili Liu，Xiaolin Wu，Mingliang Zhou以及Xinquan Jiang 等多名研究人員在Nature Communications期刊（IF=16.6）上，共同發(fā)表了題為“BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism”的文章，在該文章中，研究人員使用了購自AbMole的 JQ1（M2167）和 Zoledronic acid（M5032）兩種產(chǎn)品，揭示了BRD9通過IFN-β信號介導的染色質(zhì)重塑，對破骨細胞生成的負反饋調(diào)控機制，以及其應(yīng)用于骨病研究的潛力。

含溴結(jié)構(gòu)域蛋白9（BRD9）是非經(jīng)典BAF染色質(zhì)重塑復合物的一個組成部分，在髓系決定和巨噬細胞炎癥反應(yīng)過程中至關(guān)重要。且破骨細胞起源于髓系，與造血系中的巨噬細胞有著共同的來源。但是目前對于BRD9在破骨細胞生成和骨病中的作用機制的了解仍然有限。

研究人員用M-CSF和RANKL培養(yǎng)BMDMs，發(fā)現(xiàn)在破骨細胞生成過程中，RANKL處理后BRD9的表達逐漸上調(diào)（圖1A-B）。隨后通過特異性地刪除BRD9來構(gòu)建基因敲除小鼠（LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠）模型（圖1C）。μCT分析和組織學染色（圖1D-E）結(jié)果顯示，與對照組小鼠相比，LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠股骨骨小梁的骨量減少，礦化度下降。

圖1A. 在RANKL誘導后的指定天數(shù)，BMDMs中Brd9 mRNA的表達（通過qPCR測量）。B. 在RANKL誘導后的指定天數(shù)，BMDMs中的BRD9、MMP9、CTSK和ACP5蛋白表達。C. LysM表達系中的Brd9缺失圖解。將帶有包含Brd9外顯子6-外顯子7的loxP位點（Brd9fl/fl）的小鼠與表達由溶菌酶M啟動子驅(qū)動的Cre重組酶（LysM-Cre）的小鼠雜交。D. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窩對照小鼠股骨的H&E染色。星號表示骨量減少。E. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窩對照小鼠股骨的Von Kossa染色。星號表示骨礦化減少。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，突變體小鼠股骨骨面上來自LysM+髓系的螯合蛋白酶K（CTSK）+破骨細胞的細胞數(shù)量明顯增加，且雖然LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和對照小鼠的成骨活性相當，但前者骨表面的侵蝕程度更高（圖2），說明Brd9消減后破骨細胞的譜系分化增強，骨吸收加快，從而導致骨量過度流失。

圖 2 LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窩對照組小鼠4周齡時鈣素/茜素紅S（ARS）標記的可視化。星號表示侵蝕的骨表面。白色虛線勾勒出股骨遠端生長板。

然后通過給小鼠的BMDMs注射RANKL，在體外誘導破骨細胞分化。研究人員發(fā)現(xiàn)，在RANKL誘導后，使用BRD9的抑制劑iBRD9處理的BMDMs中，破骨細胞特異性基因的表達增加（圖3A）。而在沒有RANKL誘導的情況下，iBRD9對破骨細胞生成沒有明顯影響，表明BRD9的功能依賴于RANKL（圖3B-C）。且RANKL處理后上調(diào)的BRD9以負反饋機制，抑制RANKL誘導的破骨細胞分化。

圖 3 A. 使用qPCR檢測在RANKL誘導的BMDMs中加入不同濃度的iBRD9一天后，Acp5和Mmp9的mRNA表達情況。B. 用WB測定用或不用RANKL誘導的1 μM iBRD9或載體處理3天后，BMDMs中FOS和CTSK的蛋白表達。M-CSF，M；RANKL，R。C. 通過qPCR測量，在1 μM iBRD9或載體處理3天后，無論有無RANKL誘導，BMDMs中Acp5和Mmp9的mRNA表達。

此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，經(jīng)iBRD9處理后，RANKL誘導的BMDMs中IFN-β信號活性下調(diào)（圖4A）。且在抑制BRD9的BMDMs中加入IFN-β1細胞因子后，可以抑制破骨細胞的生成（圖4B），提示BMDMs中IFN-β信號轉(zhuǎn)導的轉(zhuǎn)錄激活可能有助于BRD9介導的破骨細胞生成過程中的負反饋調(diào)節(jié)。

圖 4 A. MR+iBRD9組和對照組的GSEA圖和聚類熱圖。B. 通過qPCR測量在破骨細胞誘導過程中，用1 μM iBRD9和0.0625 ng/ml IFN-β1處理2天的BMDMs中Acp5和Mmp9的mRNA表達。

隨后，通過免疫沉淀（ChIP）測序，基因KEGG富集以及蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，研究人員發(fā)現(xiàn)STAT1是相互作用最多的樞紐基因之一，同時也是IFN-β信號活動的主要介質(zhì)（圖5A-C）。且據(jù)觀察，Stat1缺陷小鼠的骨中存在過度的破骨細胞生成，表明其對破骨細胞分化具有負調(diào)控作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Stat1表達下調(diào)可能是BRD9抑制破骨細胞過度生成的一個關(guān)鍵過程。

圖 5 A. 使用WB測量破骨細胞分化后不同時間下，BMDMs中IFN-β、STAT2和STAT1的蛋白表達。B. 4周齡小鼠股骨遠端STAT1(紅色)和CTSK(綠色)的免疫熒光染色。C. RANKL誘導3天后BMDMs中STAT1(綠色)、TRAP染色(紅色)和肌動蛋白(紅色)的免疫熒光。

接下來研究人員將預測的Stat1近端啟動子和增強子克隆到載體中進行實驗，發(fā)現(xiàn)抑制BRD9能明顯降低Stat1啟動子和增強子的轉(zhuǎn)錄活性（圖6A）。且ChIP-qPCR結(jié)果顯示，BRD9可以直接與Stat1的啟動子和增強子結(jié)合（圖6B）。說明BRD9能通過直接調(diào)節(jié)Stat1的啟動子和增強子活性從而促進Stat1的轉(zhuǎn)錄。

圖 6 A. 在用iBRD9或?qū)φ蛰d體處理的破骨細胞誘導的RAW264.7中，Stat1啟動子單獨或在增強子區(qū)域存在下的熒光素酶報告子活性。B. 破骨細胞誘導過程中，RAW264.7細胞系BRD9抗體(或IgG)的芯片分析。

隨后，通過分析ATAC-seq數(shù)據(jù)(圖7A)以及基因組中共定位情況，選擇轉(zhuǎn)錄因子FOXP1進行研究。免疫共沉淀(IP)分析證實，在破骨細胞分化期間，BMDMs中BRD9和FOXP1之間存在物理相互作用(圖7B)。ChIP-qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP1可以直接與Stat1的啟動子和增強子結(jié)合，但在抑制BRD9后FOXP1與Stat1的結(jié)合功能會受到影響（圖7C）。提示FOXP1是BRD9在Stat1轉(zhuǎn)錄激活和破骨細胞分化過程中進行負反饋調(diào)節(jié)的關(guān)鍵輔助因子之一（圖7D）。

圖 7 A. 抑制BRD9后DAR基序富集損失的點氣泡圖。B. 在破骨細胞誘導過程中用FOXP1抗體(或IgG)在BMDMs中進行Co-IP分析，隨后用BRD9和FOXP1進行免疫印跡。C. 用 iBRD9 或載體處理 RANKL 誘導過程中的 RAW264.7 細胞，對FOXP1抗體（或IgG）進行ChIP檢測。D. BRD9介導的染色質(zhì)重塑。

之后研究人員通過比較BRD9和BRD4被抑制后的轉(zhuǎn)錄譜，探索BRD9與BRD4的功能特異性，發(fā)現(xiàn)兩者的功能特異性主要存在于細胞周期和破骨細胞分化過程。

隨后又以脂多糖（LPS）誘導的牙槽骨損傷為模型進行實驗，發(fā)現(xiàn)Brd9缺失小鼠對牙槽骨的局部急性損傷（圖8A-B）和破骨細胞活性（圖8C-D）具有抗性。且含有BRD9降解劑的改良可注射光固化SF（圖8E）可以降低破骨細胞活性（圖8F-G）以及LPS/ligation刺激的急性局部骨質(zhì)流失（圖8H-I）等指標。說明在感染刺激情況下，BRD9的缺失或降解在骨組織中的抗炎作用可能比在基礎(chǔ)條件下更為明顯。

圖 8A-B. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠（n=4）和同窩對照小鼠（n=9）上頜骨中LPS誘導的局部牙槽骨損失的μCT成像（A）和量化（B）。C-D. 4周齡LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠（n=3）和同窩對照小鼠（n=4）經(jīng)LPS刺激上頜骨的TRAP染色（C）和量化（D）。E. dBRD9降解劑處理示意圖。F-G. 對6周齡小鼠上頜骨BRD9降解劑處理側(cè)和對照側(cè)，經(jīng)LPS誘導的局部牙槽骨進行TRAP染色(F)以及量化(G)。H-I. 對6周齡小鼠上頜骨BRD9降解劑處理側(cè)（右側(cè)）和對照側(cè)（左側(cè)）經(jīng)LPS誘導的局部牙槽骨損失進行μCT成像(H)和量化(I)。

該研究使用了購AbMole 的 JQ1(M2167)和Zoledronic acid(M5032)兩種產(chǎn)品。其中JQ1是BRD4的抑制劑，Zoledronic acid是一種可以抑制破骨細胞骨吸收，以及破骨細胞分化相關(guān)分子表達的化合物。

實驗中使用JQ1抑制BRD4，并與BRD9被dBRD9降解后的轉(zhuǎn)錄譜相比較。發(fā)現(xiàn)兩組差異最明顯的是細胞周期和破骨細胞分化過程。并且細胞周期相關(guān)的特征基因在JQ1組明顯下調(diào)（圖9），提示其在破骨細胞生成過程中的潛在作用導致了dBRD9和JQ1的相反效應(yīng)。

研究人員通過使用Zoledronic acid建立頜骨壞死（ONJ）小鼠模型，并發(fā)明一種含有BRD9降解劑的改良型可注射光固化蠶絲纖維素（SF），在拔牙后立即填充到牙槽骨窩中。通過μCT成像評估顯示，ONJ-dBRD9組小鼠的臼齒拔除窩內(nèi)充滿了組織良好的新形成的骨小梁（圖10A），且骨壞死和骨膜反應(yīng)的發(fā)生率比ONJ-對照載體組的小鼠降低80%（圖10B）。表明應(yīng)用dBRD9研究Zoledronic acid誘導的ONJ是一種有前景的策略。

圖 10 A. dBRD9降解劑處理組和對照組小鼠上頜骨的μCT成像。黃色箭頭1表示嚴重的骨膜反應(yīng)。黃色箭頭2表示骨質(zhì)疏松的上頜竇底。黃色箭頭3表示骨硬化和死骨。星號表示骨量不足。B. dBRD9降解劑處理組和對照組小鼠上頜骨骨壞死和骨膜反應(yīng)的發(fā)生率。

綜上所述，研究人員揭示了BRD9-FOXP1-STAT1軸在破骨細胞負反饋途徑中的重要作用，進一步拓展對染色質(zhì)重塑因子、轉(zhuǎn)錄因子以及信號通路之間互作網(wǎng)絡(luò)的認識，為開發(fā)破骨細胞相關(guān)骨病的研究策略提供了啟示。

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鳴謝：Du J, Liu Y, Wu X, et al. Nat Commun. 2023 Mar 14;14(1):1413.