寡核苷酸的應用盤點及其固相合成步驟詳解
寡核苷酸合成是許多分子生物學應用的基礎，包括聚合酶鏈反應 (PCR)、基因編輯、DNA 測序和基因治療。寡核苷酸主要是用固相合成方法制造的。目前，固相合成方法已經發(fā)展到允許合成數(shù)公斤數(shù)量的寡核苷酸用作藥物分子 (如反義寡核苷酸)。固相化學合成是由 Robert Bruce Merrifield 在 20 世紀 60 年代發(fā)明的，其重要性使得他在 1984 年獲得了諾貝爾化學獎。此外，固相合成方法也廣泛應用于多肽合成、寡糖合成和組合化學等領域。
寡核苷酸是通過磷酸二酯基團連接在一起的核苷類線性聚合物。想要了解寡核苷酸合成過程，首先需要了解它的組成單體核苷酸和核苷的結構。
核苷由一個堿基和一個糖組成。核苷酸則有一個額外的磷酸基。核苷、核苷酸和五個天然堿基的結構如圖 1 所示[1]。通過磷酸二酯基團連接將一個核苷的 3'-羥基連接到下一個核苷的 5'‐羥基，從而形成核酸鏈。
▐ 寡核苷酸引物和探針
合成寡核苷酸最普遍的用途是用作探針和引物。作為引物，寡核苷酸通常用于引發(fā)酶促反應，以生成短或長靶序列的數(shù)百萬至數(shù)十億個副本。眾所周知的例子是聚合酶鏈式反應 (PCR) 或 Sanger 測序方法。寡核苷酸引物的應用包括 DNA 測序、基因表達 (Real Time PCR)、基因克隆和分子診斷。作為探針，寡核苷酸用于鑒定以及結合特定的 DNA 或 RNA 靶序列，以確認該序列在特定樣本中的存在。使用寡核苷酸探針的應用包括 Northern 印跡 (用于 RNA)，Southern 印跡 (用于 DNA)，或熒光原位雜交技術 (FISH，可以檢測結合了熒光探針的 DNA 區(qū)域或 RNA 在染色體或其他細胞器中的定位)。
目前就有文章報道可以利用設計的 FISH 探針 (CoronaFISH) 可視化新冠病毒SARS-CoV-2 的 RNA (圖 2)，作為微陣列中的熒光基團偶聯(lián)序列，可檢測基因表達的變化，或者用于篩選遺傳疾病或鑒定特定病原體 (分子診斷)。
此外，核酸適配體熒光探針利用核酸適配體與靶分子的高親和性對活細胞甚至是亞細胞結構 (如 RNA、代謝物、蛋白等) 進行熒光成像分析 (圖 3)。
▐ 寡核苷酸治療/基因治療
在治療應用中，反義寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides, ASOs)，小干擾 RNA (Small interference RNA, siRNA)，微小 RNA (Micro-RNA, miRNA) 和核酸適配體 (Aptamers) 等可以通過堿基互補配對原則與 DNA、mRNA 或者 pre-mRNA 配對，并通過一系列過程調節(jié)基因表達，如 RNA 干擾，RNase H 介導的靶基因降解和剪接調制等[4]。寡核苷酸療法在精確醫(yī)療方面的潛力激發(fā)了人們將寡核苷酸藥物應用于癌癥、心血管疾病和罕見疾病治療的熱情。目前，涉及多個疾病領域的 18 種寡核苷酸類藥物 (包含退市藥物) 已獲得批準上市。
表 1. 已批準上市的寡核苷酸藥物[1][2]。
固相合成方法是將核苷亞磷酰胺單體按照特定順序偶聯(lián)到固體載體上。核苷亞磷酰胺單體是固相合成的構建基塊，在合成時將核苷亞磷酰胺單體按照特定順序偶聯(lián)到固體載體上。其中 2'/5'-OH 和雜環(huán)氨基被保護基團保護以防止合成過程中的副反應。圖 2 顯示了亞磷酰胺單體的結構以及常見的保護基團[1]。保護基團被設計成在不同的 pH 值下選擇性地去除。選擇性地去除保護基團，使所需要的官能團顯露出來，保證了反應選擇性的控制。
寡核苷酸固相合成方法是一種化學合成方法，一般是從 3' 向 5' 方向進行的，不同于核酸生物合成過程從 5' 向 3' 方向延伸。每個合成周期延長一個核苷酸。
在寡核苷酸合成的開始階段，第一個受保護的核苷是通過載體表面上的羥基或氨基官能團被預先連接到固相載體上。在合成循環(huán)中，寡核苷酸鏈從第一個被預先固定在固相載體表面上受保護的核苷向后延伸。其中，固體載體 (也稱為樹脂) 是不溶性顆粒，通常直徑為 50-200 μm，廣泛采用的固相載體是可控微孔玻璃 (CPG) 和聚苯乙烯 (PS) 兩類載體。試劑被泵入并流經固相載體表面，誘導分步添加的核苷酸單體加入到寡核苷酸鏈上，使寡核苷酸鏈不斷延長。反應步驟包括：1. 脫保護基團 (Detritylation)，2. 活化和偶聯(lián) (Activation and Coupling)，3. 氧化 (Oxidation)，4. 加帽 (Capping)。
圖 5. 寡核苷酸的固相合成過程[1]。
1. 脫保護基團：在寡核苷酸合成之前，用三氯乙酸 (TCA) 脫去連接在固相載體上的核苷 5'-DMT 保護基團，獲得游離的 5'-OH 基團，以供下一步縮合反應。2. 活化和偶聯(lián)：將過量核苷亞磷酰胺單體與四氮唑活化劑混合并進入合成柱，核苷亞磷酰胺單體的二異丙基氨基團被活化劑質子化，與游離的 5'-OH 發(fā)生親和反應，縮合并脫去四唑，從而形成磷酸三酯鍵，此時合成的寡核苷酸鏈延長一個堿基。3. 氧化：在偶聯(lián)反應過程中形成的亞磷酸三酯是不穩(wěn)定的，必須在下一個循環(huán)開始之前將其轉化為更穩(wěn)定的結構。需要氧化試劑將亞磷酸三酯轉化為穩(wěn)定的磷酸三酯。最常使用的氧化試劑是碘溶于四氫呋喃/吡啶/水的溶液。所得磷酸三酯是由 2-氰基乙基保護。氰基乙基基團防止后續(xù)合成循環(huán)中磷酸三酯發(fā)生其他反應。偶聯(lián)步驟對水分敏感，在下一次偶聯(lián)之前，必須用乙腈洗滌除去殘留的水。4. 加帽：加入的核苷亞磷酰胺單體與預先連接在載體上的核苷無法實現(xiàn) 100% 的反應。這意味著預先連接在載體上的核苷仍然會有一些未反應的游離的 5'-OH 基團。如果不加以控制，這些 5'-OH 基團將參與下一個偶聯(lián)步驟。這樣產生的寡核苷酸將缺少一個堿基。因此，需要將剩余的 5'-OH 基團封閉。常用的加帽試劑有乙酸酐和 N -甲基咪唑 (NMI)。之后，每個堿基重復這個循環(huán)一次，最終產生所需的寡核苷酸。
近些年發(fā)展了一些修飾試劑，可以在合成寡核苷酸時對于一些核苷進行化學修飾。許多化學修飾可以改善寡核苷酸的藥代動力學特性、耐受性和靶向結合親和力。硫代磷酸 (PS)、磷酸二酰胺嗎啉基 (PMO) 和肽核酸 (PNA) 設計都賦予了對核酸酶的抵抗力和細胞內增強攝取能力，從而增加了寡核苷酸的效力。tcDNA 是構象受限的 DNA 類似物，在全身給藥后在組織中具有增強的效力和攝取能力。此外，在核糖的 2ʹ 位置進行的修飾包括 2'-O-甲基 (2'-OMe)、2'-O-甲氧乙基 (2'-MOE) 和鎖核酸 (LNA) 使寡核苷酸更耐核酸酶降解，進一步增加穩(wěn)定性，還提高了其與靶基因的親和力，減少了非特異性蛋白結合帶來的毒性[4][5]。
MCE 擁有專業(yè)的研發(fā)團隊和先進的檢測設備，可提供寡核苷酸相關產品的定制合成服務，進行相關的檢測服務（純度、結構和穩(wěn)定性分析等)，確保產品的有效性與一致性，提供優(yōu)質高效的服務品質。
相關服務
• siRNA 合成：提供單基因套裝 (3 保 1) 和 siRNA 文庫。
• miRNA 合成：提供 miRNA mimics 和 miRNA inhibitors 文庫。
• 引物/基因定制合成：支持提供多樣的化學修飾 (如鎖核酸 LNA，硫代磷酸化，氟代，2’-OMe，2’-MOE 等) 和熒光標記 (CY3，CY5，和 FAM 等)。
• 寡核苷酸偶聯(lián)：可偶聯(lián) PEG、脂質、小分子化合物、或多肽等。
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靶向補體因子 5 (C5)，抑制 C5 剪切為 C5a 和 C5b，可用于研究與年齡相關的黃斑變性 (AMD)。 |
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靶向 Transthyretin (TTR) 信使 RNA，可用于研究遺傳性 TTR 淀粉樣蛋白癥的研究。 |
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靶向人源 apoB-100，用于純合子家族性高膽固醇血癥的研究。 |
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修飾 SMN2 基因的 pre-mRNA 剪接，從而促進全長 SMN 蛋白的生成，用于脊髓性肌萎縮癥的研究。 |
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一種亞磷酰胺單體，可用于寡核苷酸合成。 |
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一種亞磷酰胺單體，可用于寡核苷酸合成。
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[1] Pourshahian S. THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES, IMPURITIES, DEGRADANTS, AND THEIR CHARACTERIZATION BY MASS SPECTROMETRY. Mass Spectrom Rev. 2021;40(2):75-109.
[2] Rensen E, et al. Sensitive visualization of SARS-CoV-2 RNA with CoronaFISH. Life Sci Alliance. 2022;5(4):e202101124.
[3] Neubacher S, et al. RNA Structure and Cellular Applications of Fluorescent Light-Up Aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(5):1266-1279.
[4] Roberts TC, et al. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-694.
[5] Rinaldi C, et al. Antisense oligonucleotides: the next frontier for treatment of neurological disorders. Nat Rev Neurol. 2018;14(1):9-21.
