IC50值的應(yīng)用、檢測原理測定方法和數(shù)據(jù)計算及分析詳解
小 M, 小 M, 我導(dǎo)兒開始安排測 IC50 了，雖然查文獻(xiàn)經(jīng)常遇到……但還是暈，概念分不清？不懂如何測？有啥區(qū)別？確實(shí)！大家常在文獻(xiàn)中看到 IC50、EC50、ED50 等數(shù)值的測定，實(shí)驗不迷茫~我們先從大家最熟悉的 IC50 值開始。
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IC50 值及其應(yīng)用場景
IC50 (Half maximal inhibitory concentration) 又叫半數(shù)抑制濃度，So，單位是濃度單位，比如 nM、µM 等等。
IC50 用來指示某一藥物或者物質(zhì) (抑制劑) 對某些生物過程 (包含此過程中的某些物質(zhì)，如酶，細(xì)胞、受體或是微生物) 達(dá)到 50% 抑制效果時的濃度。IC50 值越低，表示其抑制效力更強(qiáng)。
我們常在文獻(xiàn)中看到 IC50、EC50、ED50 等等數(shù)值的測定，這些指標(biāo)被廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、毒理學(xué)、基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域，為理解藥物效應(yīng)和優(yōu)化治療策略提供了有力支持。
IC50 值的應(yīng)用：
1. 藥物篩選和開發(fā)
- 初步篩選：在藥物發(fā)現(xiàn)過程中，IC50 值用于篩選潛在的藥物候選分子，以確定其對特定靶標(biāo)如酶抑制的活性。
- 優(yōu)化化合物：通過比較不同化合物的 IC50 值，研究人員可以優(yōu)化藥物分子的結(jié)構(gòu)，提高其效能。
- 細(xì)胞生物學(xué)研究：IC50 用于評估化合物對癌細(xì)胞或其他細(xì)胞類型的毒性，幫助研究其對細(xì)胞生長和存活的影響。
- 毒理學(xué)研究：在藥物安全性評估中，IC50 值用于確定化合物對正常細(xì)胞的影響，評估其潛在的副作用。
- 聯(lián)合用藥研究：通過測定單獨(dú)藥物和聯(lián)合用藥的 IC50，研究不同藥物之間的相互作用和協(xié)同效應(yīng)，以優(yōu)化治療方案。
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常用實(shí)驗的 IC50 值測定
一、激酶抑制劑的 IC50 值，如何測？
為了尋找新型的 CaMKII 抑制劑作為治療人類心臟疾病的潛在藥物，作者利用高通量系統(tǒng)進(jìn)行篩選，并在第二次篩選中，對 33 個有潛力的分子化合物進(jìn)行了 IC50 值測定，所得 IC50 最低的前 10 種化合物如下 (圖 1)[1]。
圖 1. 抑制 CaMKII-δ 激酶 IC50 值最低的前 10 個分子及其結(jié)構(gòu)曲線[1]。
▐ 操作步驟 (供參考[1])
(1) 激酶自磷酸化：通過將 2 ng/μL CaMKIIδ 重組蛋白與 0.2 mM CaCl2、10 mM MgCl2、0.01 mM ATP、200 μM autocamtide-3 (CaMKII-δ 的肽底物)、30 nM CaM 和 0.1 g/mL BSA (來自牛血清的白蛋白) 在含有 25 mM Tris-HCl pH 7.5 的緩沖液中孵育來實(shí)現(xiàn)的。
(2) IC50 值測定：對初篩所得 33 個分子化合物復(fù)篩 ，將其按實(shí)驗設(shè)計加入激酶反應(yīng)體系中，進(jìn)行 IC50 值測定。
(3) 發(fā)光測定：通過發(fā)光測定監(jiān)測 CaMKII-δ 磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（注意：如果激酶反應(yīng)不是在室溫下進(jìn)行，在加入 ADP-Glo™ 試劑之前，將板平衡至室溫）。
(4) 記錄發(fā)光：使用微孔板讀數(shù)儀記錄讀數(shù)。
(5) 數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)以平均值 ±SEM 表示。使用 GraphPad Prism 版本 8.01 (GraphPad Software, Inc.) 和 SPSS 24.0 軟件包 (IBM SPSS Statistics，版本 24.0) 進(jìn)行統(tǒng)計分析。
發(fā)光檢測原理：
當(dāng) CaMKII-δ 被激活時，它會通過將 ATP 轉(zhuǎn)化為 ADP 來磷酸化底物。在該測定中，CaMKII-δ 的肽底物 (Autocamtide-3) 的磷酸化與 ATP 到 ADP 的轉(zhuǎn)變酶促偶聯(lián)。ADP-Glo 試劑用于終止激酶反應(yīng)并去除未反應(yīng)的 ATP。加入激酶檢測試劑終止 ATP 消耗反應(yīng)并將 ADP 轉(zhuǎn)化為 ATP，然后通過熒光素酶反應(yīng)將 ATP 進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為光。
圖 2. 發(fā)光檢測酶活性原理圖。
二、細(xì)胞毒活性試驗的 IC50 值，如何測？
為了揭示吡啶和噻唑衍生物的抗癌活性，以阿霉素為對照藥，使用 MTT 法測試噻唑基吡啶類化合物對肺癌 (A549) 細(xì)胞系的體外抗癌作用，對其進(jìn)行了 IC50 值測定[2]。
圖 3. 吡啶和噻唑衍生物對肺癌 (A549) 細(xì)胞系的抑制作用[2]。
(1) 化合物制備：將合成的化合物及參考藥物阿霉素溶解于 DMSO 中。準(zhǔn)備不同濃度的工作溶液以供實(shí)驗使用。
(2) 細(xì)胞處理：將預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞系暴露于不同濃度的測試材料，在 37°C 下孵育 24 小時。使用 PBS 清洗去除死細(xì)胞。
(3) MTT 染色：向每個孔加入 25 µL 0.5% MTT 染液。在 37°C 條件下孵育 3-4 小時。
(4) 溶解與讀數(shù)：加入 0.05 mL DMSO 溶解細(xì)胞內(nèi)形成的甲瓚晶體，并在搖床上放置 30 min。利用 ELISA 板讀數(shù)儀測量各孔的吸光度值。
(5) 數(shù)據(jù)分析：重復(fù)實(shí)驗三次，計算平均值。細(xì)胞存活率計算公式為：(處理組吸光度/對照組吸光度) × 100%。使用 Master –plex-2010 程序確定 IC50 值。
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IC50 值的數(shù)據(jù)計算
IC50 值的是通過劑量反應(yīng)曲線 (Dose-Response Curve) 生成，具體方法可能因?qū)嶒炘O(shè)計和使用的分析軟件而有所不同，這需要進(jìn)行一系列不同濃度的藥物處理實(shí)驗。
▐ IC50 值的數(shù)據(jù)處理
- 實(shí)驗設(shè)計：進(jìn)行細(xì)胞或酶實(shí)驗，將靶標(biāo) (如細(xì)胞系、酶等) 暴露于多個不同濃度的藥物中。
- 記錄數(shù)據(jù)：測量藥物對靶標(biāo)的抑制效果，例如細(xì)胞存活率、酶活性或代謝產(chǎn)物變化。
- 處理數(shù)據(jù)：將所得表格數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使用 Graphpad prism 軟件計算—創(chuàng)建表格—輸入濃度和抑制率—點(diǎn)擊 Analyze，選擇對數(shù)變換--通過非線性回歸 (Non-linear regression) 對實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合---得 IC50 值，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為 S 型曲線。
圖 4. IC50 值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
需要注意的是！雖然 IC50 的應(yīng)用十分廣泛，但 IC50 值是通過體外實(shí)驗獲得的，僅為體外數(shù)據(jù)，不能完全反映藥物在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的效果。
04
ED50、TD50 和 LD50
活性數(shù)值在藥理學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域非常重要，用于描述藥物或分子與靶標(biāo)之間的相互作用及效果，對于理解藥物作用機(jī)制、優(yōu)化化合物結(jié)構(gòu)以及指導(dǎo)臨床用藥等方面都具有重要意義。
下圖是小 M 為大家整理的關(guān)于 ED50、TD50 和 LD50 的簡要匯總~
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小結(jié)
本期主要為大家介紹了 IC50，并為大家整理了關(guān)于 ED50、TD50 和 LD50 的簡要匯總！下期為大家介紹它的好 “兄弟” EC50~，當(dāng)然還有其他活性數(shù)值，內(nèi)容精彩，值得等待！未完待續(xù)……
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產(chǎn)品推薦 |
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MTT 是一種黃色的水溶性四唑鹽，活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶可以將 MTT 還原成不溶性的紫色結(jié)晶甲瓚，通過測量甲瓚的顏色變化來反映細(xì)胞活力。 |
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Cell Counting Kit-8 (HY-K0301) WST-8 在電子載體 1-Methoxy PMS 的作用下，可以被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶還原成水溶性的橙黃色甲臜 (formazan)。 |
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WST-1 誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶進(jìn)行 NADH 依賴的酶切反應(yīng)，釋放出水溶性的甲臜產(chǎn)物，通過測定 450 nm 處的吸光值來反映細(xì)胞活力。 |
參考文獻(xiàn)：
[1] Zhang J, et al. Novel CaMKII-δ Inhibitor Hesperadin Exerts Dual Functions to Ameliorate Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury and Inhibit Tumor Growth. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.
[2] Ashmawy FO, et al. Synthesis, In Vitro Evaluation and Molecular Docking Studies of Novel Thiophenyl Thiazolyl-Pyridine Hybrids as Potential Anticancer Agents. Molecules. 2023 May 23;28(11):4270.
[3] Gui, H., et al. Effects of Boletus Poisoning on Estrogen Receptors and Neurotransmitters in Rats Based on ERk1/2 Pathway. Neural Process Lett 55, 193–203 (2023).
[4] Abal P, et al. Acute Oral Toxicity of Tetrodotoxin in Mice: Determination of Lethal Dose 50 (LD50) and No Observed Adverse Effect Level (NOAEL). Toxins (Basel). 2017 Feb 24;9(3):75.
