細胞螢光素酶報告基因檢測受多種因素影響，例如載體狀態(tài)，細胞狀態(tài)，轉(zhuǎn)染量，轉(zhuǎn)染效率，裂解效率，加樣精度等等，因此實驗中一般需要做3個或以上復(fù)孔，且最好采用雙螢光素酶報告基因，以保證實驗結(jié)果的可信度�，F(xiàn)將雙螢光素酶實驗檢測中常見的問題匯總?cè)缦拢?br />  

Q1:如何選擇載體？

螢火蟲螢光素酶一般選取pGL-3、pGL-4或pmirGLO的載體，也可自己構(gòu)建相應(yīng)的載體；

 

 

海腎螢光素酶一般選取phRL-TK或pGL-4載體，建議不使用強啟動子（如SV40，CMV），而選取中等強度的啟動子
 

Q2:檢測結(jié)果螢光值過低或無螢光值怎么辦？

多種情況均可導(dǎo)致檢測結(jié)果螢光值過低或無螢光，具體原因和解決辦法如下：

1,啟動子活性低

a.優(yōu)化細胞的培養(yǎng)條件，提高螢光素酶的表達量；

b.更換強啟動子（如SV40、CMV）。

2,轉(zhuǎn)染效率低

a.優(yōu)化轉(zhuǎn)染實驗條件，用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽性對照（如轉(zhuǎn)染過表達螢光蛋白質(zhì)粒）；

b.確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質(zhì)量進行鑒定；

c.選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細胞進行轉(zhuǎn)染。

3,樣品裂解效率低

a.細胞培養(yǎng)時間不宜過長，12-36h內(nèi)最好，長時間培養(yǎng)后，細胞可能會難裂解；

b.加入的裂解液需足量，保證細胞能夠充分裂解。

4,檢測過程操作不規(guī)范

a. 選擇合適的檢測儀器，如Luminometer 發(fā)光計、多功能酶標儀或者其他能夠檢測生物發(fā)光的儀器都適用于該實驗；

b.需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；

c.保證室溫反應(yīng)。酶促反應(yīng)對溫度較為敏感，反應(yīng)時各個組分（細胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫（20-25℃）再使用；

d.螢光素酶的體外半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內(nèi)完成；

e. 檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標板。黑色酶標板也可用，但因黑色會吸收光信號，可能會降低信號。

5,底物氧化失效

a.底物避光密封保存，螢火蟲螢光素酶底物-20℃保存；海腎螢光素酶底物推薦-80℃保存；

b. 反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

Q3:如何判斷轉(zhuǎn)染成功？

1，如轉(zhuǎn)入的miRNA帶螢光標記如GFP，則可直接在轉(zhuǎn)染后、細胞裂解前，顯微鏡下觀察細胞螢光；

2，如轉(zhuǎn)入的miRNA不帶任何螢光標記，可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測，通過檢測結(jié)果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達；

3，設(shè)置一個螢光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參照組，同批轉(zhuǎn)染一個組的細胞，間接反映出同批次實驗的轉(zhuǎn)染情況。

Q4:細胞裂解物可以存放多久？

常溫一般不超過6小時，-20℃可以保存一個月，-80℃可以保存半年。

Q5:螢光素酶作為報告基因相比于螢光蛋白有哪些優(yōu)勢？

螢光素酶的靈敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同時具有更寬的動態(tài)范圍，便于數(shù)值分析比較，不需要螢光顯微鏡，而且在活體實驗中其螢光穿透性高于GFP等螢光蛋白，同時由于沒有內(nèi)源活性、其本底信號很低。而GFP等螢光蛋白相比于螢光素酶的優(yōu)勢在于可以進行示蹤定位，并且其觀測不需裂解細胞，方便進行適時觀察。

Q6:為什么我的實驗復(fù)孔無法重復(fù)？

實驗復(fù)孔有一定差異是正常的，通常只要在一個數(shù)量級之內(nèi)即可。如果差異超出這個范圍，則需要考慮以下2個方面，一是細胞裂解后離心取上清，保證樣本均一性；二是保證加樣的準確性，移液器要定期校準，確保移液精準。

Q7:檢測結(jié)果螢光值越高越好么？

螢光值過高可能會超出儀器檢測范圍從而檢測不到結(jié)果，一般讀數(shù)在5-6之間較好，螢光值過高可通過減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量或?qū)α呀猱a(chǎn)物進行稀釋后檢測，不建議通過減少螢光底物來降低螢光值，因為底物飽和才能反映螢光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

螢光素酶實驗的應(yīng)用

螢光素酶作為報告基因技術(shù)的一種，具有快速、靈敏、準確的優(yōu)點，常應(yīng)用于以下幾種生物學(xué)研究：

1，啟動子活性分析：啟動子區(qū)是RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)，啟動子的結(jié)構(gòu)直接關(guān)系到轉(zhuǎn)錄的效率，螢光素酶實驗可用于驗證待測啟動子是否有活性及其活性區(qū)域；也可實現(xiàn)組織特異性啟動子篩選及確定；以及用于新順式作用元件發(fā)現(xiàn)及功能鑒定。

2，啟動子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合驗證：將待檢測的啟動子序列構(gòu)建在報告基因上游，同時在細胞實驗中共表達轉(zhuǎn)錄因子，分析螢光素酶表達水平，即反映轉(zhuǎn)錄因子是否調(diào)控基因的表達，轉(zhuǎn)錄因子能增強或抑制啟動子的啟動能力。

3，驗證microRNA與靶基因是否存在調(diào)控關(guān)系：microRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，microRNA大部分通過成熟體種子區(qū)與3’UTR結(jié)合抑制蛋白翻譯�？梢詫⒛康幕�因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至報告基因luciferase的下游，再共轉(zhuǎn)入microRNA，如果螢光素酶表達下降，可以說明microRNA對目的基因的抑制作用；

4，啟動子SNP分析：單個核苷酸變異，簡稱SNP，通過構(gòu)建螢光素酶報告基因系統(tǒng)研究SNP位點的增強子與轉(zhuǎn)錄因子是否結(jié)合最為直接。

5，分析信號通路是否激活：將待檢測信號通路的下游相應(yīng)元件序列構(gòu)建入報告基因載體，檢測不同上游條件下，其螢光素酶活性，即下游信號通路的響應(yīng)情況。